Molekulární patogeneze vzácných anémií - erytroenzymopatie

Mgr. Pavla KOŘALKOVÁ

Disertační práce

Abstract:

The aim of this research is to make a contribution to the molecular pathogenesis of erythroenzymopathies, rare hereditary disorders causing nonspherocytic hemolytic anemia. This work represents an advanced and up-to-date knowledge in the field of red blood cells enzyme deficiencies in the Czech and Slovak populations since the nineteen-eighties when mutations in Czech and Slovak subjects resulting in glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and pyruvate kinase (PK) deficiencies were described. Both deficiencies are the most common erythroenzymopathies worldwide. Since 2013, our laboratory has focused on the introduction of direct enzyme assays followed by genetic testing in patients with hemolytic anemia with suspected erythroenzymopathy. To date, several different enzyme defects were diagnosed in twenty-four patients. Except G6PD and PK deficiencies (9 and 12 cases), 2 families with glucose phosphate isomerase (GPI) defect and 1 family with very rare hexokinase (HK) deficiency have been identified. The last two deficiencies were diagnosed in the Czech and Slovak populations for the first time. Among the 22 identified mutations, 5 of them, namely G6PD p.(Phe216Tyr), PK p.(Arg518Leufs*12), p.(Asp293Val) and GPI p.(Ser160Pro), p.(Arg472Cys) were novel and have not been previously reported in literature. Furthermore, this thesis describes a pathogenic mechanism of several novel mutations responsible for deficiencies of hexokinase (HK), phosphoglycerate kinase (PGK) and phosphofructokinase (PFK) in more detail. HK deficiency is a very rare disorder that has been rarely studied at molecular level. In collaboration with other research centers, the largest cohort of HK deficient patients was selected and extensively studied. Using molecular techniques and in silico analyses, potential pathogenic mechanisms of novel mutations p.(His867Tyr), p.(Thr600Met), c.873-2A>G and c. 493-1G>A have been elucidated. Further, we contributed to the identification and characterization of a novel intronic mutation c.756+3A>G in PGK1 in two brothers with PGK deficiency. Although PGK deficiency is mostly associated with hemolytic anemia and neurological impairment, muscle weakness and myopathy were the only clinical features in these cases. Finally, we contributed to the detection of a novel mutation p.(Asp309Gly) in PFKM gene, the first case of a rare PFK deficiency diagnosed in a 65-year-old female of Spanish origin. Characterization of erythroenzymopathies by biochemical and molecular analyses can contribute to a better understanding of pathophysiology of this rare disorder. Furthermore, the direct enzyme assays may have a wide variety of scientific/diagnostic applications; it may improve diagnostic testing of other disorders or it may be useful to study the mechanism of drug's actions.

Abstract:

Tato práce se zabývá studiem molekulární patogeneze enzymopatíí - vzácného onemocnění způsobující vrozenou nesférocytární hemolytickou anémii. Deficit glukosa-6-fosfátdehydrogenasy (GPD) a pyruvátkinasy (PK) byl v české a slovenské populaci popsán již v 80. letech. Nicméně až tato studie představuje zatím chybějící ucelený přehled o výskytu tohoto onemocnění v české a slovenské populaci, zvláště pak jeho vzácnější formy. Od roku 2013 se naše laboratoř zabývá metodou přímého stanovení enzymů s následným genetickým vyšetřením u pacientů se suspektní enzymopatií. V současné době jsme jedinou specializovanou laboratoří zabývající se touto diagnostikou v České republice resp. ve střední Evropě. Doposud byl enzymový deficit diagnostikován u dvaceti čtyř pacientů. Vedle nejčastějších deficitů G6PD a PK (9 a 12 případů), byly identifikovány 2 rodiny s deficitem glukosafosfátisomerasy (GPI) a 1 rodina s velmi vzácným deficitem hexokinasy (HK). Deficit GPI a HK byl v české a slovenské populací diagnostikován poprvé. Celkově bylo identifikováno dvacet dva kauzálních mutací, z nichž pět nebylo doposud v literatuře popsáno - G6PD p.(Phe216Tyr), PK p.(Arg518Leufs * 12), p.(Asp293Val), GPI p.(Ser160Pro) a p.(Arg472Cys). Současně tato práce studuje patogenní mechanismy vybraných mutací vedoucí k deficitu HK, fosfoglycerátkinasy (PGK) a fosfofruktokinasy (PFK). Deficit HK byl pouze výjimečně studován na molekulární úrovni. Na základě zahraniční spolupráce jsme vytvořili a detailněji prostudovali největší soubor pacientů s tímto deficitem. Patogenní mechanismus kauzálních mutací p.(His867Tyr), p.(Thr600Met), c.873-2A>G a c.493-1G>A byl objasněn pomocí molekulárních technik a in silico analýz. Dále jsme identifikovali a charakterizovali novou intronovou mutaci c.756+3A>G v genu PGK1 vedoucí k PGK deficitu. Ve většině případů je deficit PGK spojen s hemolytickou anémií a neurologickými poruchami. Avšak v tomto případě byla svalová slabost a myopatie jediným klinickým příznakem. Dále jsme u pacientky španělského původu identifikovali a charakterizovali novou mutaci p.(Asp309Gly) v genu kódující PFK. Jedná se o první případ PFK deficitu ve Španělsku. Charakterizace erytroenzymopatií pomocí biochemických a molekulárních analýz může přispět k porozumění patofyziologie tohoto vzácného onemocnění. Navíc metoda přímého stanovení erytrocytárních enzymů může vést ke zlepšení diagnostiky jiných onemocnění či je možné ji využít při studiu farmakologických sloučenin.

Keywords

erytrocyty, anémie, enzymopatie

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 5. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 28. 6. 2017

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Lékařská biologie / Lékařská biologie