Studium molekulárních struktur metodami moderní elektronové mikroskopie

Bc. Matyáš Pinkas

Bachelor's thesis

Studies of molecular structures using modern methods in electron microscopy

Abstract:

Tato bakalářská práce se zaměřuje na studium struktury transkripčního elongačního faktoru Spt6 pomocí transmisního elektronového mikroskopu s fázovou destičkou. Pro správnou funkci proteinu Spt6 je kritická interakce jeho SH2 domény s RNA polymerázou II. Cílem této práce je zisk struktury Spt6 a jeho komplexu s částí RNAPII, která patří mezi kandidáty na přirozený ligand Spt6. K tomu lze využít právě transmisní kryo-elektronové mikroskopie. Tatometoda pozoruje vzorek ukotvený v amorfním ledu v takřka nativních podmínkách, což spolu s moderními komponenty elektronových mikroskopů, jako jsou fázová destička či přímý detektor elektronů, umožňuje zisk biologicky relevantní trojrozměrné struktury s rozlišením až 3 A. Díky tomu se kryo-elektronová mikroskopie stává jednou z nejdůležitějších metod strukturní biologie, významně konkurující rentgenové krystalografii i nukleární magnetické rezonanci. Z naměřených dat se podařilo vytvořit 3D model komplexu Spt6 a části RNAPII, který ovšem nedosahuje dostatečně vysokého rozlišení k identifikaci navázaného ligandu, zároveň ovšem ukazuje potenciál fázové destičky při 3D rekonstrukci pomocí kryoEM.

Abstract:

This thesis studies the structure of transcription elongation factor Spt6, using a transmission electron microscope equipped with the Volta phase plate. The correct function of Spt6 is determined by an interaction of its SH2 domain with RNA polymerase II. The aim of this thesis is to resolve structures of Spt6 protein and its complex with a part of RNAPII that figures in a list of Spt6 potential natural ligands. One of the methods, capable of biological structure reconstruction, is cryo-electron microscopy. This method is based on observing a well preserved sample embedded in amorphous ice. Alongside the newest technology involved, such as phase plate or direct electron detector, this enables resolving biologically relevant protein structures up to resolution of 3 A. Therefore, cryo-electron miscroscopy has become one of the most impactful methods in structural biology field, possessing abilitites to compete with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance. Measured data was used to produce a 3D structure model of complex of Spt6 and its putative ligand. complex. However, this model does not reach the resolution needed to recognize and identify the ligand. Nevertheless, this thesis shows the Volta phase plate as a powerful tool in cryo-electron microscopy.

Keywords

Spt6, SH2 doména, Kryo-elektronová mikroskopie, Transmisní elektronová mikroskopie, Analýza jednotlivých částic, Fázová destička, SH2 domain, Cryo-electron microscopy, Transmission electron microscopy, Single particle analysis, Phase plate

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 26. 6. 2018
• Supervisor: Mgr. Karel Kubíček, PhD.
• Reader: Ing. Tibor Füzik, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Physics / Biophysics