Proteín-proteínové interakcie v odpovedi na oxidačný stres u rastlín

Mgr. Pavol MELICHER

Doctoral thesis

Protein-protein interactions in plant oxidative stress response

Abstract:

Reactive oxygen species (ROS) are inevitable byproducts of aerobic metabolism that serve as key signaling molecules or gene expression modulators. Plants have developed various enzymatic and non-enzymatic ROS decomposing mechanisms, which are tightly regulated by diverse mechanisms. Superoxide dismutases (SODs) are metalloenzymes that catalyze the dismutation of harmful superoxide anion radicals. The mechanisms regulating antioxidant enzymes are diverse and involve protein-protein interactions (PPIs). RECEPTOR FOR ACTIVATED C KINASE 1 A (RACK1A) is a scaffold protein affecting development and stress responses by various PPIs with proteins involved in hormonal or MAPK pathways, by regulating miRNA biogenesis or translation. However, antioxidant enzymes such as SODs have been identified as potential RACK1A-interacting partners. The first part of this thesis aimed to uncover the protective role of Fe-SUPEROXIDE DISMUTASE 1 (FSD1) under different Cu2+ availability and examine the mechanisms of FSD1-dependent responses of Arabidopsis to methyl viologen (MV). Study of fsd1 mutant plants complemented with GFP-fused FSD1 proteins revealed that FSD1 is a crucial component of chloroplast antioxidant machinery, protecting plants against elevated superoxide under low Cu2+ and contributes to protection of [Fe-S] cluster- and Fe-binding proteins, such as ferredoxins (Fd) and ferritins (Fer). FSD1 proved to be inevitable for the stability of ascorbate peroxidases (APX) in stroma, thylakoids and cytoplasm under MV-induced oxidative stress. Moreover, differential proteomics of early responses of fsd1 mutants to MV revealed that FSD1 absence is closely associated with regulation of light-harvesting complex (LHC) assembly, maintenance of photosystem I (PSI) integrity and altered primary metabolism. Additionally, we identified plasma membrane-bound protein PATELLIN 4 (PATL4) as a novel player in the plant oxidative stress responses. Plants lacking PATL4 displayed increased tolerance to MV, which might be related to its regulatory roles in stomatal development and stomatal movements as revealed by microscopy observations. Within the next part, the developmental roles and localization of Arabidopsis RACK1A were examined. It was found that RACK1A is involved in the root development and may be involved in salt stress responses. RACK1A is preferentially localized in meristemoids, young stomata guard cells, lateral root primordium founder cells and meristematic tissues, implying its important roles in dividing cells. Moreover, interactions of RACK1A with SODs were examined by yeast two-hybrid assay, ratiometric bimolecular fluorescence complementation assay and by bioinformatic predictions. This resulted in validation of the interaction with specific SODs, and identification of possible amino acid residues involved in interactions. Subsequent genetic, biochemical and phenotypic analyses of single mutants and double knock-out mutants of RACK1A and selected SOD uncovered that RACK1A mediates SOD functions, and this interaction affects plant development and regulates plant oxidative stress responses.

Abstract:

Reaktívne formy kyslíka (ROS) sú nevyhnutnými medziproduktmi aeróbneho metabolizmu, slúžiace ako signálne molekuly alebo modulátory génovej expresie. Rastliny si vyvinuli rôzne enzymatické a neenzymatické mechanizmy odbúravania ROS, ktoré sú často rôzne regulované v stresových podmienkach aby ochránili bunky pred oxidačným poškodením. Superoxiddizmutázy sú enzýmy katalyzujúce dizmutáciu škodlivého superoxidového aniónového radikálu. Mechanizmy regulujúce antioxidačné enzýmy sú rôznej povahy a zahŕňajú tiež proteín-proteínové interakcie (PPI). RECEPTOR PRE AKTIVOVANÚ C KINÁZU 1A (RACK1A) je proteín zapojený do vývoja a regulácie stresových odpovedí interakciou s rôznymi hormonálnymi dráhami, MAPK dráhami, ale aj reguláciou biogenézy miRNA alebo kontrolou translácie. Avšak, aj antioxidačné enzýmy ako sú napríklad SOD boli identifikované ako potenciálni interakční partneri RACK1A. Prvá časť tejto práce sa najskôr zameriava na odhalenie ochranných úloh Fe SUPEROXIDDIZMUTÁZY 1 (FSD1) v rôznych podmienkach dostupnosti Cu2+ a snaží sa popísať mechanizmy FSD1-závislej odpovede Arabidopsis na metylviologén (MV). Výsledky práce odhalili, že FSD1 chráni chloroplasty a fotosyntetický aparát pred MV-indukovaným oxidačným stresom v závislosti na dostupnej Cu2+. Štúdium fsd1 mutantných rastlín komplementovaných GFP-fúzovanými formami FSD1 odhalilo nenahraditeľnú úlohu chloroplastovej FSD1 v obrane pred oxidačným stresom indukovaným MV. FSD1 chráni rastliny pred zvýšenou produkciou superoxidu v podmienkach nízkej Cu2+ a prispieva tak k ochrane [Fe-S] klaster-obsahujúcich a Fe-viažucich proteínov ako sú feredoxíny a feritíny. FSD1 sa tiež preukázala ako nevyhnutný faktor podmieňujúci stabilitu askorbátperoxidáz (APX) v cytosóle, stróme a tylakoidoch v podmienkach oxidatívneho stresu. Naviac, diferenciálna proteomická analýza fsd1 mutantov v skorej odpovedi na MV odhalila, že nedostatok FSD1 je úzko prepojený s reguláciou skladania svetlozberných komplexov (LHC), udržiavania integrity fotosystému I (PSI) a zmenou metabolických funkcií. Ďalej tiež proteomická analýza napomohla identifikovať PATELLIN 4 (PATL4), proteín lokalizovaný na plazmatickej membráne, ako nový proteín zapojený do odpovede rastlín na oxidačný stres. Rastliny s chýbajúcim PATL4 preukázali zvýšenú toleranciu na MV, čo môže byť spojené s regulačnou úlohou PATL4 počas vývinu stomát a reguláciou ich zatvárania ako odhalila aj mikroskopická analýza. V ďalšej časti boli preskúmané vývojové a lokalizačné úlohy RACK1A proteínu u Arabidopsis. Bolo zistené, že RACK1A je zapojený do vývinu koreňa a môže byť zapojený do odpovede rastlín na soľný stres. RACK1A sa akumuluje v meristemoidoch, mladých bunkách stomát, základných bunkách primordia laterálnych koreňov a meristémových pletivách koreňa a prvého pravého listu, čo napovedá o jeho dôležitej úlohe v deliacich sa bunkách. Naviac bola v tejto práci študovaná interakcia RACK1A so SOD s využitím kvasinkového dvojhybridného systému, pomerovou bimolekulárnou fluorescenčnou komplementáciou a bioinformatickými predikciami. To viedlo k potvrdeniu interakcie s vybranými SOD a identifikácii aminokyselín zapojených do týchto interakcií. Následné genetické, biochemické a fenotypové analýzy jednoduchých mutantov a dvojitého knock-out mutanta génu RACK1A a vybranej SOD odhalili, že RACK1A ovplyvňuje jej funkciu, a že táto interakcia vplýva na vývinové procesy ale aj odpoveď rastlín na oxidačný stres.

Keywords

metylviologén, oxidačný stres, proteín-proteínové interakcie, reaktívne formy kyslíka, RECEPTOR PRE AKTIVOVANÚ C KINÁZU 1A, superoxiddizmutáza

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 9. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: doc. Ing. Tomáš Takáč, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry