Kryokonzervace ejakulátu býků v různých objemech a oplozovací schopnost spermií po rozmrazení

Ing. Zuzana Biniová

Doctoral thesis

Cryopreservation of bovine ejaculates of different volumes and fertilization ability of sperms after thawing

Abstract:

Cílem práce bylo vyhodnotiv vliv různých metod rozmrazení na kvalitativní parametry spermatu mrazeného velkém objemu (4, 8 a 12 ml) a dále vliv objemu mrazeného ejakulátu (4, 8 a 12 ml) na kvalitativní ukazatele spermatu po rozmrazení na kvalitativní ukazatele inseminačních dávek vyrobených metodou dvojího mrazení (DF). Z důvodu vysokých nároků na množství ejakulátu byl pokus rozdělen do dvou metodických okruhů dle cílů práce.V prvním metodickém okruhu byly porovnávány tři rozdílné způsoby rozmrazení ejakulátu: metoda 1 (M1) – pomalá, metoda 2 (M2) - středně rychlá) a metoda 3 (M3) – rychlá. Celkem bylo vyrobeno n=216 vzorků od 4 býků holštýnského (H) a 4 býků českého strakatého plemene (Č). V čerstvém ejakulátu byl stanoven podíl spermií s přímočarou aktivitou (AP) a proveden HOS test, s jehož pomocí se zjišťuje podíl spermií s nenarušenými membránami (NM). Následně byl ejakulát naředěn v poměru 1:3 a naplněn do obalů v množství buď 4 ml nebo 8 ml nebo 12 ml, od každého objemu byly vyrobeny a zamrazeny vždy tři vzorky. Ty byly následně rozmrazeny jednou z výše uvedených metod. Z rozmrazeného spermatu byl opět stanoven podíl spermií s NM a AC bezprostředně po rozmrazení a 30 minut po rozmrazení. Ze získaných údajů byly vypočteny rozdíly mezi sledovanými ukazateli.V druhém metodickém okruhu byla hodnocena úspěšnost mrazení v objemech 4 ml, 8 ml a 12 ml. Do pokusu bylo zařazeno 7 býků H a 6 býků Č, celkem bylo vyrobeno n=195 vzorků. V čerstvém ejakulátu byly stanoveny pomocí systému CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer) následující parametry aktivity spermií: aktivita celková (AC), aktivita přímá (AP), aktivita rychlá (AR) a aktivita pomalá (APO). Dále by stanoven NM. Z každého odebraného ejakulátu byla vyrobena sada vzorků o objemu 4 ml, 8 ml a 12 ml, k ředění byl využit poměr 1:3. K rozmrazení byla použita M1. V rozmrazených ejakulátech byly hodnoceny stejným způsobem parametry aktivity jako v čerstvém ejakulátu (bezprostředně po rozmrazení, 30 a 60 minut po rozmrazení) a NM. Z rozmrazeného ejakulátu byly metodou dvojího mrazení (DF) vyrobeny inseminační dávky o koncentraci 20 mil spermií/mm3. V nich byly opět stanoveny parametry aktivity (bezprostředně, 60 a 120 minut po rozmrazení) a NM.Z hodnocení výsledků vyplynulo, že statisticky průkazně bylo dosaženo nejlepších hodnot aktivity, respektive dynamiky jejich změn, u vzorků rozmrazených metodou 1. Statisticky průkazně nejvyšších hodnot aktivity bylo dosaženo u vzorků mrazených v objemu 8 ml a to jak u velkoobjemových vzorků, tak i u inseminačních dávek vyrobených metodou DF. U DF inseminačních dávek vyrobených z objemu 8 ml byl rovněž zjištěn statisticky průkazně nejvyšší podíl spermií s NM. V obou částech pokusu byl potvrzen statisticky průkazný vliv plemene na mrazitelnost ve velkém objemu, přičemž u H byla zjištěna vyšší rezistence k negativním vlivům mrazení. Byly potvrzeny statisticky průkazné korelace mezi parametry aktivity po prvním a druhém rozmrazení vzorku a mezi hustotou čerstvého ejakulátu a parametry aktivity v DF inseminačních dávkách. Lepších výsledků bylo dosaženo u vzorků vyrobených z ejakulátů o nižší hustotě. Dále byly potvrzeny statisticky průkazné rozdíly v kvalitě DF inseminačních dávek na individuální úrovni. Inseminační dávky vyrobené metodou dvojího mrazení nedosáhly ve svých průměrech stanovených standardů pro komerční využití. Nicméně na individuální úrovni je někteří býci překonali nebo se jim značně přiblížili. Můžeme tak předpokládat, že při další optimalizaci výrobního postupu DF dosáhne těchto standardů vyšší počet býků.

Abstract:

The aim of this study was to evaluate effect of different thawing methods on qualitative parameters of sperms frozen in large volumes (4, 8 and 12 ml) and the effect of different large volumes (4; 8 and 12 ml) on qualitative parameters of semen after first thawing and on quality of insemination doses processed by Double Freezing (DF) method. Taking into consideration large quantities of semen needed, the experiment was divided into two methodical scopes.Three different thawing methods were compared in the first methodical scope: Method 1 (M1) – slow, Method 2 (M2) – medium, Method 3 (M3) – fast. Total n=216 samples were processed from 4 Holstein (H) and 4 Czech Simmental (CS) bulls. Forward motility (FM) and percentage of sperms with intact membranes (IM) were analyzed from the fresh ejaculates using qualified estimation and hypoosmotic swelling test (HOS test). Set of three ejaculates of either 4 ml or 8 ml or 12 ml volumes was produced from each collection in dilution 1:3. Each set of samples was thawed using above mentioned thawing methods. FM and IM were analyzed from thawed semen by the same methods, FM was analyzed immediately and 30 minutes after thawing. Changes of obtained values between fresh and frozen-thawed semen were counted. The effects of freezing in different volumes (4; 8 and 12 ml) were evaluated in the second methodical scope. Total n=195 samples from 7 H and 6 C bulls were analyzed. Following parameters of motility were analyzed from fresh ejaculates using Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA): Total Motility (TM), Forward Motility (FM), Rapid Motility (RM) and Slow Motility (SM). IM were analyzed using HOS test. Set of three samples of 4; 8 and 12 ml volumes was produced from each ejaculate in dilution 1:3. Samples were thawed using M1. Motility of thawed sperms was analyzed using CASA immediately after thawing, 30 and 60 minutes after thawing. HOS test was used to detect IM. Frozen-thawed ejaculates were diluted to final concentration 20 mil sperms/mm3, filled in and frozen in mini straws (second freezing = DF straws). FM and IM were detected after second freezing-thawing cycle using the same methods. M1 was determined as the most appropriate thawing method after the statistical analyses of quality parameters and changes of their dynamics in frozen-thawed semen. Statistically important differences were found between samples frozen in different large volumes with 8 ml volume showing the best results of motility parameters in both, large volume and DF straws. The highest percentage of IM was also found in DF straws processed from 8 ml volume. The effect of breed was statistically important in both methodical scopes indicating higher resistance of H to negative effects of freezing. There were also found statistically important correlations between motility after first and second freezing; and between sperm concentration in fresh semen and motility in DF straws. Better results were obtained from fresh ejaculates of lower sperm concentration. The individuality of donor bull also statistically affected the quality of DF straws. However, DF straws have not reached the quality standards required to commercial use in any observed groups. On the other hand, some bulls reached or were closely approaching them individually. Thus, we can anticipate that more bulls could reach the standards after further optimization of DF method.

Keywords

dvojí mrazení, sperma býků, velký objem

Keywords

large volumes, bovine semen, double freezing

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 8. 2019

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Luděk Stádník, Ph.D.
• Reader: Miroslav Maršálek, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme / field:
Animal Science / Special Animal Science