Úloha vybraných transkripčních faktorů v řízení diferenciace a programované buněčné smrti krevních buněk

RNDr. Petr Vaňhara, Ph.D.

Doctoral thesis

Role of selected transcription factors in regulation of differentiation and programmed cell death of blood cells

Abstract:

Předkládaná disertační práce je zaměřena na popis molekulárních mechanismů řídících základní biologické procesy, zejména apoptózu a diferenciaci ve dvou hematopoetických modelových systémech - monoblastové linii BM2 a makrofágové linii RAW264.7. Prvním cílem této práce je objasnění vlivu ektopické exprese proteinu c-Jun na fenotyp sérově deprivovaných monoblastů BM2, druhým cílem potom charakterizace účinku cytokinu Growth/Differentiation Factor - 15 (GDF-15) na osteoklastovou diferenciaci makrofágů RAW264.7. Protein c-Jun představuje nezastupitelný transkripční faktor podílející se na regulaci základních biologických dějů, zejména proliferace, diferenciace a apoptózy. V této práci byla provedena fenotypová analýza sérově deprivovaných buněk BM2cJUN inducibilně exprimujících gen kódující transkripční faktor c-Jun, a následně charakteristika exprese, resp. aktivity některých G1/S regulátorů buněčného cyklu. Protein c-Jun v sérově deprivovaných monoblastech BMcJUN2 indukuje expresi cyklinu A a následně zvyšuje i aktivitu partnerské cyklin-dependentní kinázy 2 (CDK2). Mimo to, buňky BM2cJUN, s vysokou intracelulární hladinou c-Jun, ale nikoliv kontrolní BM2, masivně podléhají programované buněčné smrti. Apoptózu buněk BM2cJUN je možné omezit inhibicí CDK2 pomocí specifického purinového analogu, roscovitinu. Prokázali jsme tak funkční spojení mezi transkripčním faktorem c-Jun, regulací buněčného cyklu a indukcí apoptózy v leukemických monoblastech. V rámci druhého cíle disertační práce byl zaveden model osteoklastové diferenciace založený na makrofágové linii RAW264.7 a doplněný o hematopoetické prekurzory získané kostní dřeně myší. Model byl kvantitativně charakterizován na morfologické i molekulární úrovni. Na takto charakterizovaném systému byl popsán inhibiční vliv cytokinu GDF-1 (TGF) na tvorbu i funkci zralých osteoklastů. Molekulární mechanismus zahrnuje inhibici transkripčního faktoru NFB cestou akumulace inhibitoru IB a útlum exprese genů c fos, carII a ctsK. Navíc, protein GDF-15 obsažený v kondiciovaném médiu buněk adenokarcinomu prostaty citlivých k 1,25(OH)2vD3 (linie LNCaP) inhibuje tvorbu osteoklastů podobně jako purifikovaný protein. Naopak kondiciované médium odvozené z buněk adenokarcinomu prostaty, které neprodukují GDF-15 v odpovědi na 1,25(OH)2vD3 (linie PC3) tento efekt nevyvolává. Výsledky práce na modelu osteoklastové diferenciace popisují nový, tkáňově specifický, účinek cytokinu GDF-15 na diferenciaci osteoklastů. Data dále ukazují na možnost přímé modulace mikroprostředí kostní tkáně invadujícími prostatickými buňkami prostřednictvím 1,25(OH)2vD3-dependentní sekrece GDF 15.

Abstract:

This submitted thesis is mainly focused on characterization of transcription regulation of fundamental cellular events in blood cells, particularly proliferation, differentiation and apoptosis employing two hematopoietic models – the v-myb expressing BM2 monoblasts and osteoclastogenic RAW264.7 macrophages. First, we investigated the role of transcription factor c Jun on phenotype of starved BM2 monoblasts; second, effects of Growth/Differentiation Factor-15 (GDF-15), a distant member of TGF superfamily, on osteoclasts differentiation were characterized. c-Jun has already been demonstrated to slow down proliferation and induce differentiation of BM2 cells under optimal cultivation conditions. However, particular mechanisms responsible for that effect were not described. To distinguish influence of serum growth factors on cell cycle machinery, we cultivated BM2 cells under low serum conditions (starvation), starved BM2 monoblasts expressing c Jun were then characterized on cellular and molecular level. We found that c-Jun induces expression of cyclin A and increases activity of cyclin A:CDK2 complex. Moreover, serum deprived BM2 cells expressing c-Jun, but not the control BM2 cells, undergo massive apoptosis. Roscovitin, a purine analogue of ATP that specifically inhibits CDK2, prevents activation of programmed cells death in BM2 cells. Thus, we demonstrated that transcription factor c Jun can under serum deprivation induce programmed cell death via activation of cyclin A:CDK2 rather than differentiation. Next, a model of osteoclast differentiation, based on RAW264.7 macrophages and primary bone marrow precursors, was introduced and characterized on morphological, functional and molecular levels. Then, effects of Growth/differentiation factor 15 (GDF-15) on MCSF-RANKL induced differentiation were tested. In this work we describe that GDF-15 suppresses differentiation and function of osteoclasts by inhibition of activity of NFB by IB accumulation. Next, expression levels of c-Fos, carbonic anhydrase II and cathepsin K were found significantly downregulated. Moreover, GDF-15 containing conditioned media obtained from osteoblastic prostate cell line LNCaP induced by 1,25(OH)2vD3 inhibits osteoclast formation to the same extent as purified GDF-15. This effect is not dependent on production of osteoprotegerin, a physiological inhibitor of RANKL signaling. We described a new role for GDF-15 extending its influence to bone tissue. Our results show a possibility of direct modulation of bone microenvironment by invading cancer cells via 1,25(OH)2vD3 mediated interactions.

Keywords

monoblasts, osteoclasts, differentiation, apoptosis, BM2, RAW264.7, c-Jun, c-Fos, NFkB, GDF-15

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 8. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 23. 10. 2009
• Supervisor: prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Vladimír Divoký, CSc., doc. RNDr. Eva Matalová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology