Podíl spermadhesinů v proteinovém profilu ejakulátu kanců

Bc. Michaela Sedláčková

Master's thesis

Distribution of spermadhesins in the protein profile of boar ejaculate

Abstract:

Kančí ejakulát je složen ze spermií a semenné plazmy (SP). SP je tekutina pocházející z přídatných pohlavních žláz samců a spermie se s ní dostávají do kontaktu během ejakulace. SP má za úkol zajišťovat ochranu, výživu a transport spermií při jejich pobytu v samičím reprodukčním traktu. Významnou složkou SP jsou proteiny, které se během ejakulace spermií adherují na jejich povrch a mohou hrát roli jako dekapacitační faktory, jelikož zabraňují předčasné kapacitaci spermií. Významný podíl proteinů SP kanců tvoří spermadhesiny, které hrají klíčovou roli v následných dějích vedoucích k úspěšnému oplození. Tvoří především ochranný obal na povrchu spermií a zprostředkovávají vazbu spermií do oviduktálního rezervoáru samice. Navíc se pravděpodobně účastní také interakce spermie s oocytem. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, zda se množství spermadhesinů, a to konkrétně AQN a AWN spermadhesinů, v ejakulátu jednotlivých kanců bude lišit, a proto byl sledován proteinový profil SP a spermií včetně cílené izolace proteinů z jejich povrchu u vybraných jedinců s následnou detekcí AQN a AWN spermadhesinů pomocí protilátek. Výskyt spermadhesinů v SP kanců byl potvrzen v molekulové hmotnosti kolem 11-19 kDa ve vzorcích SP, lyzátech spermií i povrchových proteinech spermií. Navíc byla prokázána i přítomnost jejich agregovaných forem. Mezi jednotlivými kanci byly zjištěny individuální rozdíly, jelikož u poměru síly signálu protilátky proti AQN k naměřené koncentraci proteinů v SP byl zjištěn statisticky významný rozdíl (p<0,05). Stejně tak byl zjištěn u relativní optické denzity poměru signálu protilátky proti AQN i AWN spermdhesinu vztažené ke koncentraci spermií. V případě neprokázání statisticky významného rozdílu pomocí denzitometrické analýzy byla však mezi kanci vidět také určitá individualita v množství detekovaných proteinů. Pomocí imunofluorescenční mikroskopie byly spermadhesiny lokalizovány na kančích ejakulovaných spermiích fixovaných aceton/metanolem především v oblasti akrozomální čepičky, krčku a střední části bičíku, zatímco spermadhesiny na ejakulovaných spermiích připravených v suspenzi byly pomocí protilátky lokalizovány na povrchu celé hlavičky i bičíku spermie. I když u vzorků jednotlivých kanců byla v množství navázaných AQN a AWN spermadhesinů patrná individualita mezi nimi, je nutné se do budoucna zaměřit na detailnější popis funkčích parametrů spermií, aby byla jasně prokázána souvislost mezi množstvím spermadhesinů v ejakulátu kanců a jejich fertilizační schopností.

Abstract:

Boar ejaculate is composed of sperm and seminal plasma (SP). SP is a fluid that comes from the male accessory glands, and spermatozoa come into contact with it during ejaculation. SP has the task of ensuring the protection, nutrition and transport of spermatozoa during their stay in the female reproductive tract. An important component of SP are proteins that adhere to the surface of sperm during ejaculation and can play a role as decapacitation factors, as they prevent premature capacitation of sperm. A significant portion of boar SP proteins are spermadhesins, which play a key role in subsequent events leading to successful fertilization. They primarily form a protective coating on the sperm surface and mediate the binding of sperm to the oviductal reservoir of the female. In addition, they participate in the sperm-oocyte interaction. The aim of this thesis was to find out whether the amount of spermadhesins, specifically AQN and AWN spermadhesins, in the ejaculate of individual boars will differ, and therefore the protein profile of SP and sperm was monitored, including the targeted isolation of proteins from their surface in selected individuals with subsequent detection of AQN and AWN of spermadhesins using antibodies. The occurrence of spermadhesins in boar SP was confirmed at a molecular weight of around 12-18 kDa in SP samples, sperm lysates and sperm surface proteins. In addition, the presence of their aggregated forms was also proven. Individual differences were found between individual boars, as a statistically significant difference (p<0.05) was found in the ratio of the antibody signal against AQN to the measured protein concentration in the SP. It was also found in the relative optical density of the signal ratio of the antibody against AQN and AWN spermdhesin related to sperm concentration. In the case of not showing a statistically significant difference using densitometric analysis; however, a certain individuality in the amount of detected proteins was also seen between the boars. Using immunofluorescence microscopy, spermadhesins were localized on boar ejaculated spermatozoa fixed with acetone/methanol mainly in the region of the acrosomal cap, the neck and the midpice of the flagellum, while spermadhesins on ejaculated spermatozoa prepared in suspension were localized using an antibody on the surface of the entire sperm head and flagellum. Even though in the samples of individual boars the amount of bound AQN and AWN spermadhesins showed individuality between them, in the future it is necessary to focus on a more detailed description of the functional parameters of sperm in order to clearly demonstrate the connection between the amount of spermadhesins in the ejaculate of boars and their fertilization ability.

Keywords

semenná plazma, protilátka, povrchové proteiny, Western blot

Keywords

seminal plasma, antibody, surface proteins, Western blot

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 4. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 16. 5. 2023
• Supervisor: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.
• Reader: Jana Antalíková, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology