Účinek různých molekulových hmotností hyaluronanu na fyziologii fagocytů

Mgr. Daniela Viačková, Ph.D.

Doctoral thesis

The effect of different molecular weight hyaluronan on phagocyte physiology

Abstract:

Hyaluronan (HA) je vysokomolekulární lineární glykosaminoglykan, který se hojně vyskytuje v mimobuněčné hmotě. HA polymery se vyskytují v organismu v mnoha molekulových hmotnostech a vykazují různé vlastnosti, z nichž některé jsou protichůdné. V přirozené formě mají velké polymery HA řadu regulačních a strukturních, hlavně protizánětlivých a antiangiogenních, vlastností. Opačné biologické účinky má nízkomolekulární HA, u něhož se předpokládá, že má angiogenní, prozánětlivé a imunostimulační účinky. Mezi tyto stimulační účinky mohou být zahrnuty aktivace krevních fagocytů a tkáňových makrofágů. Avšak mechanismy těchto protikladných účinků HA o různých molekulových hmotnostech není zcela prostudována. Proto je tato teze zaměřena na porovnání účinků nízko- a vysokomolekulárního HA na fyziologii fagocytů in vitro. Účinky vysoce čištěného HA o přesně definované molekulové hmotnosti byly testovány na myších peritoneálních a plicních makrofágových buněčných liniích. Další část byla zaměřena na hodnocení účinků různých molekulových hmotností HA na oxidativní vzplanutí lidských fagocytů. Životnost buněk, tvorba oxidu dusnatého a prozánětlivých cytokinů byly měřeny spektrofotometricky, tvorba reaktivních kyslíkových metabolitů byla měřena chemiluminiscencí zesílenou luminolem, a exprese inducibilní syntázy oxidu dusnatého byla měřená metodou Western blot. Dále byla měřena exprese CD44 a TLR2 receptorů na povrchu makrofágových linií metodou průtokové cytometrie. Aktivace lidských krevních fagocytů HA o různé molekulové hmotnosti byla detekována na základě produkce reaktivních kyslíkových metabolitů, v přítomnosti nebo nepřítomnosti lidského sérového albuminu nebo kolagenu, metodou luminolem zesílené chemiluminiscence. Výsledky této práce ukázaly, že HA o různých molekulových hmotnostech nemá vliv na životnost buněk. Je zajímavé, že HA všech testovaných molekulových hmotností nevykazoval žádný stimulační účinek na tvorbu oxidu dusnatého a prozánětlivých cytokinů myšími makrofágy samotnými nebo stimulovanými bakteriálním endotoxinem (LPS). Naopak, v této práci jsme ukázali, že HA o velmi nízké molekulové hmotnosti (oligomery) dokonce mají inhibiční účinek na tvorbu oxidu dusnatého LPS stimulovanými makrofágy. Na druhou stranu, ani exprese inducibilní syntázy oxidu dusnatého ani aktivace transkripčního faktoru NF-κB nebyla ovlivněna vybranými molekulovými hmotnostmi HA. V případě krevních fagocytů, měl HA o různé molekulové hmotnosti kontroverzní účinky na produkci reaktivních kyslíkových metabolitů, která byla částečně závislá na prostředí, ve kterém byly buňky inkubovány. Všechny testované molekulové hmotnosti HA většinou zvýšily spontánní produkci reaktivních kyslíkových metabolitů nezávisle na prostředí, ve kterém byly vzorky inkubovány. To poukazuje na pravděpodobnost HA indukované stimulace adheze fagocytů k jamce plastové desky s jejich následnou zvýšenou aktivací. V případě tvorby reaktivních kyslíkových metabolitů aktivované opsonizovaným zymosanem, všechny molekulové hmotnosti HA ve většině případů inhibovaly aktivaci fagocytů, což naznačuje inhibici interakce mezi zymosanovými částicemi a fagocyty způsobenou HA nezávisle na jeho molekulové hmotnosti. Účinek různých molekulových hmotností HA na tvorbu reaktivních kyslíkových metabolitů aktivovanou škrobem a forbol myristyl acetátem byla závislá na přítomnosti kolagenu a lidského sérového albuminu ve vzorku. V každém případě však tyto analýzy nepřinesly žádné důkazy o stimulačních účincích nízkomolekulárního HA na lidské fagocyty. Celkově vzato, tato data jsou kontroverzní vůči většině současných studií. Je nez

Abstract:

bytné provést další experimenty, které by vyřešily otázku týkající se účinků různých molekulových hmotností HA na fagocyty.

Abstract:

Hyaluronan (HA), a high-molecular-weight (HMW) linear glycosaminoglycan, is abundant component of extracellular matrix. HA polymers occur in organism in a variety of molecular weights (MW) that have a huge array of properties, some of which appear to be contradictory dependent on MW. In its native form, the very large HA polymers have an range of regulatory and structural, mainly anti-inflammatory and anti-angiogenic, functions. Contradictory biological effects are suggested for low-molecular-weight HA (LMW-HA) that is suggested to be angiogenic, pro-inflammatory and immunostimulatory. These stimulatory effects of LMW-HA could include activation of blood phagocytes and tissue macrophages. However, the mechanisms of these contrary actions of HA of different MW are not well understood. Therefore, this thesis is focused on comparing of effect of the LMW and HMW-HA on phagocyte physiology in vitro. The effects of highly purified HA of precisely defined molecular weights were tested on mouse peritoneal and lung macrophage cell lines. Further, the next part was focused on evaluation of effects of different MW HA on oxidative burst of human blood phagocytes. Viability of cells, production of nitric oxide and pro-inflammatory cytokines were measured spectrophotometricaly, production of reactive oxygen species (ROS) was measured by luminol amplified chemiluminescence, and inducible nitric oxide synthase expression was detected by Western blot analysis. Further, expression of surface HA receptors CD44 and TLR2 was determined on the of macrophage cell lines by flow cytometry. Activation of human blood phagocytes by HA of different MW was determined based on ROS production in absence and presence of human serum albumin (HSA) or collagen by luminol amplified chemiluminescence. The results of this study revealed HA of different MW did not have negative effect on the cell viability. Interestingly, HA of any MW did not exert any stimulatory effect on production of nitric oxide and pro-inflammatory cytokines by mouse macrophages alone or in combination with bacterial endotoxin (LPS). Conversely, we observed that very LMW-HA (oligomers) revealed even inhibitory effect on production of nitric oxide by LPS stimulated macrophages. On the other hand, neither expression of inducible nitric oxide synthase nor activation of transcription factor NF-κB was affected by selected MWs of HA. Further, HA revealed controversial effects on human blood phagocyte ROS production, which were partly dependent on environment, in which the cells were incubated. All tested MWs of HA mostly increased spontaneous production of ROS independent on environment. This would suggest a stimulation of phagocyte adhesion to the well of the plastic plate with consequent increase of phagocyte activation. In the case of opsonized zymosan activated ROS production, all MWs of HA mostly inhibited the activation of phagocytes which suggested the inhibition of interaction among zymosan particles and phagocytes by HA independently on its MW. Effect of different MWs of HA on starch and phorbol myristate acetate activated ROS production was dependent on the presence of collagen and HSA in the sample. However, all together these analyses did not bring any evidence of stimulatory effects of LMW-HA on human blood phagocytes. Taken together, these data are in controversy with most of the recent studies. More experiments should be done to resolve the question of the effect of different molecular weight HA on phagocytes.

Keywords

hyaluronan, macrophages, nitric oxide, iNOS, reactive oxygen species, reactive nitrogen species

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 7. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 3. 8. 2010
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Reader: MVDr. Ján Matiašovic, Ph.D., prof. RNDr. Aleš Macela, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology