Strukturální charakterizace proteinů podílejících se na homologní rekombinaci

Mgr. Jan Zálešák

Bachelor's thesis

Structural characterization of proteins involved in homologous recombination

Abstract:

Homologní rekombinace (HR) je, vedle nehomologního spájení konců (NHEJ) a jednořetězcové hybridizace (SSA), klíčovým způsobem opravy dvouřetězcových zlomů DNA (DSB) a hraje životně důležitou roli i v dalších procesech DNA metabolismu, jako je např. meióza, DNA replikace, oprava poškozené DNA obecně aj. Poruchy homologní rekombinace mohou vést k patologickým důsledkům, např. genetickým chorobám nebo karcinogenezi. Strukturní studium proteinů účastnících se HR může vést k lepšímu pochopení molekulárního průběhu těchto důležitých dějů. V této práci byly shrnuty tři základní, výše zmíněné, způsoby opravy dvouřetězcových zlomů, detailněji byl uveden průběh jednoho z nich – homologní rekombinace. Byl uveden popis DNA opravných proteinů Saccharomyces cerevisiae – Rad52 a Srs2. Dále byly uvedeny základní principy výstavby struktury proteinů a popsány nejobvyklejší proteinové strukturní motivy zajišťující interakci proteinu s DNA, DNA vazebné motivy, a popis specifik přípravy vzorků pro NMR strukturní analýzy. V rámci této práce byla provedena optimalizace přípravy fragmentů proteinů Rad52 a Srs2 pro NMR analýzy (jejich exprese, purifikace, izotopové značení a finální příprava do formy měřitelné pomocí NMR). Byla provedena jejich základní strukturní charakterizace a monitorování jejich interakce s DNA, a to především pomocí NMR metod. Práce přinesla výsledky umožňující přímé pokračování projektu a v neposlední řadě cenné dovednosti, znalosti a zkušenosti ve zkoumaných oblastech pro řešitele práce.

Abstract:

Homologous recombination, with Non-homologous end-joining and Single strand annealing, is main DNA double strand break repair pathway and plays key role in other DNA metabolism processes including meiosis, DNA replication, DNA repair etc. Defects in the homologous recombination can be at the beginning of many diseases including genetic diseases or carcinogenesis. Structural studies of proteins involved in the homologous recombination can lead to better understanding of such important processes at molecular level. This bachelor thesis reviews three most common double strand break repair pathways mentioned above and one of them, homologous recombination, is revealed in more details. It also describes two Saccharomyces cerevisiae DNA repair proteins – Rad52 and Srs2. Basics of building of protein structure were shown as well as the most common DNA-binding motifs: helix-turn-helix, zinc finger and leucine zipper. Specific requirements for NMR samples preparation were mentioned. Preparation of NMR samples of repair proteins Rad52 and Srs2 fragments was optimized (expression, purification, isotope labeling and final sample preparation optimization). Basic structural characterization of mentioned protein fragments as well as the structural monitoring of interaction with DNA was done by NMR techniques mainly. The work brought results suitable for near future project development and last but not least earned valuable abilities, knowledge and experience in studied field for the thesis author.

Keywords

Oprava DNA, homologní rekombinace, dvouřetězcové zlomy (DSBs), Rad52, Srs2, strukturní studie, nukleární magnetická rezonance

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 7. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 13. 6. 2011
• Supervisor: doc. Mgr. Lumír Krejčí, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry