Exprese izoforem hemoxygenázy ve stárnoucích oocytech prasete.

Michaela Poupalová

Master's thesis

Expression of Heme oxygenase Isoforms during aging of porcine oocytes.

Abstract:

Kvalita a oplozovací schopnost oocytů dozrávajících v in vitro podmínkách je zásadní pro jejich využití v biotechnologiích. V průběhu prodloužené kultivace dochází v oocytech k mnoha morfologickým a funkčním změnám, které mají za následek zejména snížení oplozovací schopnosti oocytů a vyšší míru apoptózy, polyspermie, partenogenetické aktivace a chromozomálních aberací. Tyto změny mají negativní vliv také na následný embryonální vývoj. Pochopení mechanismu stárnutí oocytů by tak mohlo zásadním způsobem přispět k rozvoji reprodukčních biotechnologií hospodářských zvířat a postupů v lidské asistované reprodukci. Enzym hemoxygenáza (HO) katalyzuje oxidační štěpení hemu na biliverdin, oxid uhelnatý (CO) a železnaté ionty. Existují dvě izoformy hemoxygenázy, tj. HO 1 a HO 2. HO 1 má cytoprotektivní vlastnosti a v buňkách je exprimována zejména v reakci na působení stresových faktorů. HO 2 je zodpovědná spíše za bazální produkci CO. CO se řadí mezi gasotransmitery, což jsou endogenně produkované signální molekuly plynů. Význam systému HO/CO byl prokázán v reprodukční soustavě samců i samic. Jeho význam přímo v oocytech však není znám. Cílem práce bylo ověřit hypotézu, že je HO exprimována v prasečích oocytech během jejich prodloužené kultivace v in vitro podmínkách a že se během stárnutí mění exprese jednotlivých izoforem. Hodnoceny byly oocyty ve stádiu metafáze druhého meiotického dělení (MII) a dále ve třech fázích stárnutí dle délky prodloužené kultivace, tj. 24, 48 a 72 hodin. HO 1 a HO 2 byly lokalizovány imunocytochemickou metodou. Vyhodnocením experimentů bylo potvrzeno, že v průběhu stárnutí oocytů dochází k expresi obou izoforem HO, a to ve všech hodnocených oblastech, tj. v perichromozomální oblasti, korové oblasti a cytoplazmě. HO 1 se nachází zejména v perichromozomální oblasti a během stárnutí dochází ke statisticky významnému zvyšování intenzity signálu. V korové oblasti a cytoplazmě byl detekován statisticky významný rozdíl pouze v oocytech stárnoucích 72 hodin a intenzita signálu je v těchto oblastech slabší. V případě HO 2 je signál rovnoměrně rozmístěn po celém oocytu a v porovnání s HO 1 je výrazně silnější. Ke statisticky významnému zvýšení intenzity signálu zde docházelo mezi oocyty ve stádiu MII a skupinou oocytů stárnoucích 24 hodin. Během prodloužené kultivace se tedy významně zvyšuje exprese HO 2 v porovnání s dozrálými oocyty. Vědecká hypotéza tak byla potvrzena v případě obou izoforem HO, tj. podařilo se lokalizovat HO 1 i HO 2 ve stárnoucích prasečích oocytech a zároveň zde dochází ke změnám v expresi v průběhu prodloužené kultivace. Z výsledků experimentů lze předpokládat, že se v oocytech nachází také produkty enzymatické činnosti HO 1 a HO 2, včetně CO a systém HO/CO se tak pravděpodobně uplatňuje v procesu stárnutí oocytů. Předpokladem je, že HO 1 zde působí zejména jako cytoprotektivní faktor, který by mohl pozitivně ovlivňovat kvalitu oocytů. HO 2 je pak zodpovědná zejména za bazální produkci CO, nicméně může hrát roli také v regulaci oxidačního stresu v oocytech. Získaná data je nutné prověřit dalšími experimenty zaměřenými na lokalizaci a redistribuci obou izoforem během stárnutí oocytů. Předmětem dalších výzkumů by měl být také mechanismus účinku a konkrétní funkce HO 1 a HO 2 v oocytech.

Abstract:

Quality and fertilization rate of oocytes matured in vitro conditions is essential for their use in biotechnology. Many morphological and functional changes occurs in oocytes during prolonged cultivation, which result in decreased fertilization rates and higher levels of apoptosis, polyspermy, parthenogenesis and chromosomal anomalies. These changes also have a negative effect on subsequent embryonic development. Understanding the mechanisms of oocyte aging could thus make a major contribution to the development of reproductive biotechnologies in livestock and human assisted reproduction. The enzyme heme oxygenase (HO) catalyzes the oxidative cleavage of heme to biliverdin, carbon monoxide (CO) and ferrous ions. There are two isoforms of heme oxygenase, i.e. HO 1 and HO 2. HO 1 has cytoprotective properties and in the cells is expressed especially in response to stress factors. HO 2 is responsible for basal production of CO. CO belongs to gasotransmitters, which are endogenously produced signaling gaseous molecules. Meaning of HO/CO system was proven in reproductive system of both males and females. Its importance in oocytes is not known. The aim of this thesis was to verify the hypothesis that the HO is expressed in porcine oocytes during their prolonged cultivation in vitro conditions and that the expression of both isoforms changes during aging. Oocytes were evaluated at the metaphase stage of the second meiotic division (MII) and three stages of aging according to the length of prolonged cultivation, i.e. 24, 48 and 72 hours. HO 1 and HO 2 were localized by immunocytochemistry method. By evaluating the experiments it was confirmed that both HO isoforms are expressed during aging in all evaluated areas, i.e. in the perichromosomal area, cortical area and cytoplasm. HO 1 is located mainly in the perichromosomal area and during aging occurs statistically significant increase in signal intensity. In the cortical area and the cytoplasm was detected statistically significant difference only in oocytes aging 72 hours and the signal intensity is weaker in these areas. In the case of HO 2 signal is evenly distributed throughout the oocyte and compared with the HO 1 the signal is significantly stronger. A statistically significant increase in signal intensity occurred between oocytes at the MII stage and the group of oocytes aging 24 hours. An expression of HO 2 compared with matured oocytes significantly increases during prolonged cultivation. A scientific hypothesis was confirmed in the case of both HO isoforms, i.e. HO 1 and HO 2 were localized in aging porcine oocytes and at the same time there is a change in expression during prolonged cultivation. From the results of experiments it can be assumed that products of enzymatic activity of HO-1 and HO-2, including CO are also present in oocytes, and therefore HO/CO system is probably related to the oocyte aging. The assumption is that HO 1 acts as a cytoprotective factor, which could have a possitive effect on oocyte quality. HO 2 is responsible for basal production of CO, but it may also play a role in the regulation of oxidative stress in oocytes. The data obtained should be investigated further with more experiments focused on localization and redistribution of both isoforms during oocyte aging. The subject of further research should also be a mechanism of action and specific function of HO 1 and HO 2 in oocytes.

Keywords

oocyt, oxid uhelnatý, hemoxygenáza, oogeneze, gasotransmitery

Keywords

oocyte, carbon monoxide, oogenesis, gasotransmitters, heme oxygenase

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Mgr. Markéta Sedmíková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction