Lokalizace vybraných sacharidových struktur během meiotického zrání prasečích oocytů kultivovaných in vitro.

Bc. Karolína Litošová

Master's thesis

Localization of selected carbohydrate structures during meiotic maturation of porcine oocytes cultured in vitro.

Abstract:

Zona pellucida je extracelulární glykoproteinový obal oocytů, který v průběhu oplození hraje důležitou roli při rozpoznání gamet a zabraňuje vzniku polyspermie. U prasat je ZP tvořena třemi druhy glykoproteinů – ZP2, ZP3 a ZP4. Během meiotického zrání dochází u glykoproteinů ke glykosylaci, sulfataci a sializaci, které jsou klíčové pro interakci spermie-zona pellucida. Právě rozdíly a přítomnost sacharidových zbytků ve strukturách zona pellucida a povrchových bílkovinách spermií mají významnou roli pro druhově specifickou vazbu spermií a indukci akrozomální reakce. Při primární vazbě se kapacitovaná spermie váže na neutrální N-glykany, poté dochází k akrozomální reakci a následuje sekundární vazba spermie na zona pellucida. Sacharidové složky glykoproteinů ZP lze detekovat pomocí lektinů. Lektiny jsou proteiny, které jsou schopné s vysokou specifitou nekovalentně vázat sacharidy a vytvářet s nimi glykokonjugované komplexy. Cílem této diplomové práce bylo ověřit hypotézu, že během meiotického zrání dochází ke změnám lokalizace vybraných sacharidových struktur glykoproteinů zona pellucida prasečích oocytů. K ověření stanovené hypotézy byly realizovány experimenty založené na imunofluorescenční detekci vybraných sacharidových struktur pomocí specificky se vázajících lektinů RCA (Ricinus communis agglutinin) a ConA (Canavalia ensiformis agglutinin) u prasečích oocytů v různé fázi meiotického zrání (GV, MI a MII). ConA se specificky váže na struktury D-manózy a RCA rozpoznává řetězec galaktózy vázané na N-acetylglukosamin. Obě tyto sacharidové struktury tvoří významnou sacharidovou složku glykoproteinů zona pellucida. Z výsledků experimentů zaměřených na imunofluorescenční detekci struktur D-manózy prostřednictvím lektinu ConA je patrné, že dochází k signifikantnímu nárůstu relativní intenzity signálu ConA mezi prasečími oocyty ve fázi GV a MI. Při hodnocení výsledků experimentů zaměřených na detekci řetězce galaktózy vázané na N-acetylglukosamin pomocí lektinu RCA byl opět pozorován signifikantní nárůst relativní intenzity signálu RCA mezi prasečími oocyty ve fázi GV a MI. Hypotézu této diplomové práce se tedy podařilo potvrdit. Je možné, že zmíněné sacharidové struktury a jejich epitopy mohou hrát roli v kontaktu spermie se zonou pellucidou, také je možné, že tato změna sacharidové struktury glykoproteinů zona pellucida je nezbytná pro odkrytí klíčových vazebných epitopů rozpoznávaných spermií.

Abstract:

Zona pellucida is the extracellular glycoprotein membrane of oocytes, which plays an important role in gamete recognition during fertilization and prevents polyspermy. In pigs, the ZP is composed of three types of glycoproteins - ZP2, ZP3 and ZP4. During meiotic maturation, glycoproteins undergo glycosylation, sulfation and sialation, which are crucial for sperm-zona pellucida interaction. It is the differences and the presence of carbohydrate residues in zona pellucida structures and sperm surface proteins that play an important role in species-specific sperm binding and induction of the acrosomal response. In primary binding, the capacitated sperm binds to neutral N-glycans, followed by the acrosomal reaction and then secondary binding of the sperm to the zona pellucida. The carbohydrate components of ZP glycoproteins can be detected by lectins. Lectins are proteins that are able to bind carbohydrates non-covalently and form glycoconjugated complexes with high specificity. The aim of this thesis was to test the hypothesis that during meiotic maturation, changes in the localization of selected carbohydrate structures of zona pellucida glycoproteins in porcine oocytes occur. To verify the hypothesis, experiments based on immunofluorescence detection of selected carbohydrate structures using specifically binding lectins RCA (Ricinus communis agglutinin) and ConA (Canavalia ensiformis agglutinin) were performed in porcine oocytes at different stages of meiotic maturation (GV, MI and MII). ConA specifically binds to D-mannose structures and RCA recognizes the galactose chain bound to N-acetylglucosamine. Both of these carbohydrate structures constitute an important carbohydrate component of zona pellucida glycoproteins. The results of experiments focused on the immunofluorescence detection of D-mannose structures by the lectin ConA show that there is a significant increase in the relative intensity of the ConA signal between porcine oocytes in the GV and MI phase. When evaluating the results of experiments aimed at detecting the N-acetylglucosamine-linked galactose chain via the RCA lectin, a significant increase in the relative intensity of the RCA signal was again observed between porcine oocytes in the GV and MI phase. Thus, the hypothesis of this thesis was confirmed. It is possible that the aforementioned carbohydrate structures and their epitopes may play a role in sperm contact with the zona pellucida, it is also possible that this change in the carbohydrate structure of zona pellucida glycoproteins is necessary to uncover key binding epitopes recognized by sperm.

Keywords

Glykoproteiny, in vitro maturace, lektiny, oocyty, zona pellucida

Keywords

Glycoproteins, in vitro maturation, lectins, oocytes, zona pellucida

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Ing. Tereza Krejčová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Biotechnology and Animal Breeding