Symbiotické mikroorganismy a antimikrobiální aktivita Pectinatella magnifica

Ing. Hana Salmonová

Doctoral thesis

Symbiotic microorganisms and antimicrobial activity of Pectinatella magnifica

Abstract:

Pectinatella magnifica (Leidy, 1851) je sladkovodní, bezobratlý živočich z kmene Bryozoa (Mechovci). Předmětem zájmu vědců se P. magnifica stala především díky masivnímu šíření v Evropě, Japonsku, Koreji a Číně, kde je nepůvodním druhem. V České republice se začala invazivně šířit od roku 2013 na území Jižních Čech. Usilovně je tedy studován možný vliv této mechovky na původní ekosystém a zdraví člověka. V tomto kontextu je považována za biologické znečištění, mezihostitele pro parazity ryb, nebo jako zdroj antimikrobiálních látek. Ačkoliv bylo na P. magnifica pohlíženo z různých perspektiv, žádná ze studií se nezabývá bakteriemi s ní souvisejícími. Charakterizace bakterií z kolonií P. magnifica a testování jejich antimikrobiální aktivity je dalším krokem k prohloubení vědomostí o případných interakcích této mechovky s původním ekosystémem. V průběhu 4 let byly odebírány vzorky kolonií P. magnifica na 4 lokalitách v Jižních Čechách: Hejtman, Veselí, Cep a Kanclíř, 3 krát během sezóny. Vnější povrchová vrstva a vnitřní gelová hmota byly odebírány zvlášť. Počty bakterií v koloniích mechovky a okolní vodě byly stanoveny kultivačně, a vyhodnoceny statisticky v programu STATISTICA 12 (StatSoft, Inc., USA). Z každé kultivační varianty byly odebrány bakteriální izoláty, u kterých byly po rekultivaci mikroskopicky hodnoceny morfologické znaky a čistota. Vybrané kmeny byly identifikovány pomocí MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie (Bruker Daltonik GmbH, Germany), a molekulárně genetických metod: REP-PCR a sekvenace 16S rDNA (GATC Biotech). Dále byla testována antimikrobiální aktivita bakteriálních izolátů a extraktů připravených z kolonií P. magnifica proti potenciálně patogenním bakteriím a bakteriím způsobujícím kažení potravin, agarovou difúzní metodou. U aktivních extraktů byla dále stanovena minimální inhibiční koncentrace bujónovou mikrodiluční metodou. Z výsledků této práce lze konstatovat, že P. magnifica je osidlována především alochtonními druhy, běžně se vyskytujícími v prostředí, nebo jsou blízce příbuzné druhům, které jsou méně časté, přesto detekované v ekologických nikách jiných, než jsou mechovci. Díky filtračnímu způsobu příjmu potravy zachycuje P. magnifica bakterie přítomné v okolní vodě a kumuluje je v relativně vysokých počtech. Bochnatka je také bohatým zdrojem dosud nepopsaných bakteriálních taxonů, které lze snadno kultivovat v laboratorních podmínkách. Celkem bylo nalezeno 15 potenciálně nových druhů a 3 potenciálně nové rody, z nichž dva byly detekovány pouze v koloniích P. magnifica a jejich symbiotický vztah nemůže být vyloučen. Stejně tak nelze vyloučit adaptaci či sekundárně symbiotický vztah několika dalších potenciálně nových druhů a Aeromonas spp. Kolonie P. magnifica mohou být považovány za slibný zdroj chemických sloučenin, které působí především proti grampozitivním bakteriím. Za produkci aktivních látek jsou pravděpodobně zodpovědné fakultativně symbiotické či epibiotické bakterie z prostředí, které mechovku kolonizují, nebo k ní značným způsobem přispívají. Nalezeny byly 2 kmeny Aeromonas veronii a 1 kmen Pseudomonas moraviensis, u kterých byla antimikrobiální aktivita prokázána.

Abstract:

Pectinatella magnifica (Leidy, 1851) is a freshwater invertebrate residing within the Bryozoa phylum, which has become a subject of scientific interest because of its invasive expansion in Europe, Japan, Korea and China. In water reservoirs of South Bohemia, P. magnifica is an invasive species expanding massively since 2013. For this reason, its influence on aquatic environments and human health is intensively studied. This organism has been associated with biofouling, viewed as an intermediate host for fish parasites, especially microsporidia, and as a source of antimicrobial agents. Although several studies have focused on P. magnifica from different perspectives, none of them described bacteria associated with this organism. A search for cultivatable P. magnifica-associated bacteria is needed not only to discover producers of new antimicrobial compounds, but also to gain deeper insight into the ecology and interactions of the bacteria with their environment. Four water reservoirs in South Bohemia were chosen for sampling of P. magnifica colonies and the surrounding water: Hejtman, Veselí, Cep and Kanclíř. Samples were collected over four years of survey, three times per season. A surface layer of bryozoan colonies was collected separately from the inner jelly matter. Bacterial enumeration from both structures of colonies and surrounding water was performed by cultivation and evaluated statistically using STATISTICA 12 (StatSoft, Inc., USA). From each cultivation variant, bacteria were picked, and after subsequent enrichment they were evaluated for their morphological characteristics and purity by using phase contrast microscopy. Selected strains were identified using MALDI-TOF mass spectrometry (Bruker Daltonik GmbH, Germany), and molecular genetic methods: REP-PCR and 16S rDNA sequencing (GATC Biotech). Further, bacterial isolates and five extracts prepared from P. magnifica colonies were tested for their antimicrobial activity against potential pathogens and food-spoiling psychrophilic bacteria by agar well diffusion method. A broth microdilution method was used to determine minimal inhibition concentration of active extracts.Based on the results it can be concluded that P. magnifica is colonised predominantly by allochthonous species, either described as bacteria widely spread in the environment or related to less common bacteria, but detected in environmental samples other than in bryozoans. We can say that P. magnifica acts as a biofilter that captures bacteria present in water, and accumulates them to relatively high counts. This organism is also a prolific source of hitherto unknown bacterial taxa that are able to grow easily under laboratory conditions. A total of 15 putative new species and 3 putative new genera were revealed. Two strains were detected exclusively in our samples of P. magnifica colonies, and a symbiotic association between these bacteria and the bryozoan could not be excluded. Adaptation or secondary symbiotic character of some other potential new taxa and Aeromonas spp. cannot be excluded as well. Further, P. magnicifa colonies can be considered as a promising source of chemical agents with activity especially against gram-positive bacteria. Producers of these agents are probably secondary symbionts or epibiotic bacteria from environments, that P. magnifica colonize. Antimicrobial activity showed two strains of Aeromonas veronii and one strain of Pseudomonas moraviensis.

Keywords

Pectinatella magnifica, symbiotické bakterie, antimikrobiální aktivita

Keywords

Pectinatella magnicifa, symbiotic bacteria, antimicrobial activity

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 8. 2018

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Eva Vlková, Ph.D.
• Reader: Jan Kopečný, externi, Vladimír Kmeť, externi, Jan Kopecký, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme / field:
Animal Science / General Animal Science