Imobilizace Clostripainu na magnetické nosiče a jeho využití pro fragmentaci Tau proteinu

Mgr. Lucie Matošková

Diplomová práce

Immobilization of Clostripain onto magnetic carriers and its utilization for Tau protein fragmentation

Anotace:

Diplomová práce byla zaměřena na zavedení metody stanovení aktivity proteolytického enzymu Clostripainu, optimalizaci reakčních podmínek, imobilizaci na vhodný magnetický nosič a jeho následné použití pro fragmentaci tau proteinu. Aktivita Clostripainu byla měřena pomocí chromogenního substrátu BApNA (N-?-benzoyl-D, L-arginin-p-nitroanilid). Byly optimalizovány reakční podmínky Clostripainu, a to doba aktivace enzymu, optimální reakční teplota a čas, poměr E:S. Pro imobilizaci byly vyzkoušeny různé metody kovalentní vazby. Z magnetických nosičů pro imobilizaci Clostripainu byly vybrány magnetické částice Chemicell s karboxylovými, aminovými, polyglutaraldehydovými, hydrazinovými a kyanurátovými funkčními skupinami a magnetická makroporézní perlová celulóza s -OH funkčními skupinami. Na základě výsledků byl vybrán nejvhodnější nosič a byla u něj stanovena skladovací a operační stabilita imobilizovaného Clostripainu. Specifita štěpení imobilizovaným Clostripainem byla nejprve ověřena pomocí modelového proteinu melittinu, a poté byl nosič aplikován pro fragmentaci tau proteinu. Vzorky byly analyzovány pomocí SDS-PAGE elektroforézy a MALDI-TOF-MS.

Abstract:

Presented thesis was focused on implementation of suitable method for determination of Clostripain activity, optimization of reaction conditions, immobilization onto appropriate magnetic carriers and its subsequent use for fragmentaion of tau protein. The low molecular mass substrate BApNA (N-?-benzoyl-D, L-arginin-p-nitroanilid) was used for confirmation of the activity of Clostripain. Reaction conditions of Clostripain, such as time of activation, the optimal temperature of reaction and the ratio of E:S were optimized. Various methods of covalent bonding were tested. Magnetic particles with carboxyl, amino, polyglutaraldehyde, hydrazide and cyanuric groups and magnetic macroporous bead celulose with carboxyl groups were chosen as carriers for Clostripain immobilization. Various methods of immobilization by covalent bond were tested. Based on the results, the most convenient carrier was selected, where the storage and operational stability were determined. Specifity of enzymatic digestion of immobilized Clostripain was verified using Melisin as model protein and then was carrier applied to the fragmentation of tau protein. Samples were analyzed by SDS-PAGE and by MALDI-TOF-MS.

Klíčová slova

Clostripain, endoproteináza Arg-C, magnetické částice, tau protein, Alzheimerova choroba

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 1. 6. 2010
• Vedoucí: RNDr. Lucie Korecká, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů