Studium mitogen aktivovaných proteinkinas YODA a MPK3 pod nativním promotorem u modelového organismu Arabidopsis thaliana

Bc. Markéta KOŘISTKOVÁ

Diplomová práce

Study of the mitogen-activated protein kinases YODA and MPK3 under native promoter in Arabidopsis thaliana

Anotace:

Mitogen aktivované proteinkinasy jsou esenciální pro adaptaci organismů na vnější podmínky, ale také se zapojují do vývojových procesů v buňce. MPK3 a YODA jsou důležité pro vývoj stomat, embryogenezi nebo růst rostlin. Samotná MPK3 je nezbytná pro reakci na abiotický stres způsobený vysokou salinitou nebo kyslíkovými radikály. Hlavními cíli této práce bylo molekulární klonování YODA pod nativním promotorem v C- terminální fúzi s GFP nebo RFP a dále komplementace MPK3 genu v mpk3 mutantních rostlinách Arabidopsis thaliana. Klonováním byly připraveny čtyři konstrukty pro expresi YODA pod nativním promotorem ve fúzi s GFP nebo RFP. Konstrukty byly testovány transientní transformací Nicotiana benthamiana a následně byly použity pro stabilní transformaci A. thaliana. Fúzní protein YODA-GFP byl detekován ve dvou rostlinách, což bylo poté potvrzeno i mikroskopií. Nepodařilo se selektovat žádné rostliny s YODA-RFP fúzním proteinem. Mutantní linie mpk3-1 a mpk3-5 A. thaliana s vyřazeným genem MPK3 byly transformované konstruktem exprimujícím MPK3 pod nativním promotorem ve fúzi s mCherry na C- konci. Protein MPK3-mCherry byl detekován ve velkém množství rostlin, z kterých byly selektovány homozygotní linie v generaci T3. Mikroskopickou analýzou těchto linií bylo objeveno, že MPK3-mCherry je abundantní především v cytoplasmě a jádře buněk.

Abstract:

Mitogen-activated protein kinases are essential for organism adaptation to environmental conditions, but they also take part in developmental processes. MPK3 and YODA are crucial for development of stomata, embryogenesis or plant growth. MPK3 is involved in reaction to abiotic stress caused by high salinity or reactive oxygen species. The main goals of this thesis were molecular cloning of YODA with its own promotor with GFP or RFP C-terminal fusion and complementation of MPK3 gene in mpk3-1 and mpk3-5 Arabidopsis thaliana mutant plants. Four different constructs for YODA with its own promotor and C- terminal fusion with either GFP or RFP were prepared and tested with transient transformation of Nicotiana benthamiana and used for stable transformation of A. thaliana. Protein YODA GFP was detected in two plants and the presence of the protein was later confirmed by microscopy. However, no plants with YODA-RFP protein were detected. Mutant lines mpk3-1 and mpk3-5 of A. thaliana without functional MPK3 gene were transformed with construct with MPK3 and its own promotor with mCherry on C- terminus. Presence of MPK3 mCherry was confirmed in large number of plants from which T3 generation of homozygous lines were selected and showed localization of MPK3-mCherry mainly in cytoplasm and nucleus of the cells.

Klíčová slova

mitogen aktivované proteinkinasy (MAPK), YODA, MPK3, Arabidopsis thaliana, solný stres, GFP, mCherry

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 6. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 7. 2020
• Vedoucí: Mgr. Ivan Luptovčiak, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biotechnologie a genové inženýrství