Analýza proteinových komplexů s využitím SEC-MS

Bc. Petr Lapčík

Master's thesis

Analysis of protein complexes using SEC-MS

Abstract:

Tato diplomová práce je zaměřena na dráhu NF-κB, která byla v předchozích experimentech identifikována jako potenciální prometastatický faktor u nádorů prsu subtypu luminální A. V teoretické části je popsána dráha NF-κB a zapojené transkripční faktory, které tvoří proteinové komplexy. Podstatná část teorie je pak věnována protein-proteinovým interakcím, jejich významu a metodám jejich studia; je zde představena nová metoda SEC-PCP-SILAC pro mapování protein-proteinových interakcí, která využívá izotopového značení proteinů SILAC a separace proteinových komplexů pomocí gelové permeační chromatografie s následnou LC-MS/MS identifikací. Experimentální část se zabývá studiem změn v proteomu nádorových buněk MCF7 po inhibici NF-κB dráhy inhibitory BAY-11-7082, denosumab, parthenolid a plazmidem pCMV4-IκBα∆N. Analýza změn v proteomu ukázala, že inhibice pCMV4-IκBα∆N způsobila nejvíce změn a patrně se jedná i o nejcílenější inhibici NF-κB dráhy. Za zvolených podmínek byl největší překryv nalezen mezi proteiny ovlivněnými pCMV4-IκBα∆N a BAY-11-7082, částečný překryv účinku dále vykazovaly inhibitory parthenolid a denosumab. NF-κB faktory byly identifikovány ve frakcích odpovídajících molekulovým hmotnostem vyšším než 670 kDa, což s vysokou pravděpodobností ukazuje, že proteiny NF-κB dráhy byly úspěšně identifikovány v proteinových komplexech. Poslední část práce byla věnována kultivaci buněk linie MCF7 v pěti různých médiích za přítomnosti dialyzovaného FBS, což je nezbytné pro metabolické značení proteinů SILAC jako integrální součást metody SEC-PCP-SILAC. Ačkoliv růst buněk MCF7 byl ve všech pěti variantách složení růstového média velmi pomalý, poslední výsledky dávají šanci na úspěšnou kultivaci dostatečného množství buněk pro SEC-PCP-SILAC experiment za současného zajištění vysokého stupně inkorporace značených aminokyselin.

Abstract:

This thesis is focused on NF-κB pathway which was identified as a potential pro-metastatic factor in luminal A breast cancer in previous studies. Theoretical part of this thesis summarizes current information on NF-κB pathway and involved transcription factors that form protein complexes. Another part of the theory is devoted to protein-protein interactions, their significance and methods of studying; a new SEC-PCP-SILAC method is introduced for protein-protein interaction mapping in NF-κB pathway, based on stable isotope labelling of amino acids in cell culture (SILAC), separation of protein complexes by size exclusion chromatography, and by LC-MS/MS protein identification. Experimental part focus on studying the changes in MCF7 tumor cells proteome after NF-κB pathway inhibition by BAY-11-7082, denosumab and parthenolide inhibitors and by the pCMV4-IκBαΔN plasmid transfection. Analysis of proteome changes showed that pCMV4-IκBαΔN inhibition led to the majority of observed changes, probably representing the most specific type of NF-κB pathway inhibition. Under the conditions we used, the largest overlap was found between proteins affected by pCMV4-IkBαΔN and by BAY-11-7082, and partial overlap was also observed between parthenolide and denosumab. NF-κB proteins were identified in SEC fractions corresponding to a molecular weight higher than 670 kDa, indicating that NF-κB pathway proteins have been successfully identified in protein complexes. The last part of this thesis was focused on MCF7 cell cultivation in five different growth media with dialyzed fetal bovine serum, which is essential for the SILAC metabolic protein labelling, as an integral part of the SEC-PCP-SILAC method. Although the growth of MCF7 cells was very slow in all five variants of the growth media, the most recent results indicate a chance of successful growth of MCF7 cells for the SEC-PCP-SILAC experiment, ensuring a high degree of incorporation of the labeled amino acids.

Keywords

NF-κB, karcinom prsu, NF-κB inhibitory, hmotnostní spektrometrie, SEC, SILAC, protein-proteinové interakce, SWATH, proteomika, MCF7, breast cancer, NF-κB inhibitors, mass spectrometry, protein-protein interactions, proteomics

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 8. 6. 2017
• Supervisor: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry