Izolace a charakterizace polyfenoloxidasy z hrachu

Bc. Jana HORNÍČKOVÁ

Master's thesis

Isolation and characterization of polyphenol oxidase from pea

Anotácia:

Diplomová práce je zaměřena na izolaci a charakterizaci polyfenoloxidasy z hrachu. V teoretické části je popsána struktura polyfenoloxidasy, katalyzované reakce včetně jejich základního mechanismu, popisuje enzymové hnědnutí. Dále se zabývá fyziologickou funkcí enzymu v rostlinných organismech. Následuje základní charakterizace polyfenoloxidasy v podobě teplotního a pH optima, substrátové specifity a vlivu inhibitorů na enzymovou aktivitu. Menší část literární rešerše je rovněž věnována popisu základního postupu pro izolaci enzymů. Cílem experimentální části byla optimalizace izolace a purifikace polyfenoloxidasy z hrachu a její následná charakterizace. V průběhu optimalizace byla testována sada extrakčních pufrů, precipitace balastních proteinů při 30 % - 90 % nasycení síranem amonným a odsolení na kolonkách. Enzym nebyl aktivován přídavkem SDS, z toho vyplývá, že se enzym v hrachu vyskytuje v aktivní formě. Ze substrátů preferuje pouze 4 methylkatechol, další substráty nebyly akceptovány. Ve studii vlivu inhibitorů byla zaznamenána nejnižší enzymová aktivita po vystavení kyselině askorbové. Optimální pH polyfenoloxidasy je 9 a optimální teplota je 50 stupňů Celsia. Získané poznatky mohou být použity v dalších studiích, které mohou být zaměřeny na stanovení molekulové hmotnosti enzymu a jeho struktury, na jejímž základě by mohly být navrhnuty jiné efektivní inhibitory a substráty.

Abstract:

Diploma thesis is focused on the isolation and characterization of polyphenol oxidase from pea. The theoretical part describes the structure of polyphenol oxidase, catalyzed reactions including their basic mechanism, describes enzymatic browning. It also discusses the physiological function of the enzyme in plant organisms. This is followed by a basic characterization of polyphenol oxidase in terms of temperature and pH optimum, substrate specificity and the effect of inhibitors on enzyme activity. A small part of the literature research is also devoted to a description of the basic procedure for enzyme isolation. The aim of the experimental part was to optimize the isolation and purification of polyphenol oxidase from pea and its subsequent characterization. During the optimization, a set of extraction buffers, precipitation of ballast proteins at 30 % - 90 % saturation with ammonium sulphate and column desalting were tested. The enzyme was not activated by the addition of SDS. Among the substrates, only 4-methylcatechol was preferred, other substrates were not accepted. In a study of the effect of inhibitors, the lowest enzyme activity was observed after exposure to ascorbic acid. The optimal pH of polyphenol oxidase is 9 and the optimal temperature is 50 degrees Celsius. The obtained knowledge can be used in further studies, which may be aimed at determining the molecular weight of the enzyme and its structure, on the basis of which other effective inhibitors and substrates could be designed.

Kľúčové slová

Polyfenoloxidasa, izolace enzymů, purifikace, pH optimum, teplotní stabilita, substrátová specifita, inhibice

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 4. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: Mgr. Jana Sekaninová, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry