Vliv sirných sloučenin česneku na expresi markerů časné apoptózy u prasečích oocytů

Martina Trojanová

Master's thesis

Effect of garlic sulphur compounds on expression of early apoptotic markers in porcine oocytes

Abstract:

Prasečí oocyty jsou pro svou ekonomickou dostupnost a jednoduché získávání hojně využívány pro in vitro kultivace. Na poli reprodukčních biotechnologií je kvalita oocytů jednou ze zásadních podmínek úspěšné kultivace a s rozvojem těchto disciplín se nároky na kvalitu oocytů zvyšují. V oocytech přirozeně probíhají procesy spojené se zráním, potažmo stárnutím oocytů. Prvotním jevem, který ovlivňuje využitelnost oocytů pro in vitro kultivace je apoptóza, programovaná buněčná smrt, postihující také zrající oocyty. K apoptóze dochází často v důsledku zvýšené produkce reaktivních forem kyslíku. Příjem antioxidantů z vnějšího prostředí může pomoci těmto nežádoucím vlivům předejít. Mezi látky, které mírní projevy apoptózy patří sirné sloučeniny obsažené v česneku, zejména S-allyl cystein (SAC) s vysokým antioxidativním potenciálem. Hypotézou této diplomové práce je, že sirné sloučeniny česneku pozitivně ovlivňují životaschopnost zrajících prasečích oocytů ovlivněním exprese faktorů zapojených do regulace apoptózy. Cílem bylo prokázat vliv SAC (0,1; 0,5 a 1,0 mM) na průběh meiotického zrání prasečích oocytů a expresi apoptotických faktorů ve zrajících oocytech po 24 a 48 hod. kultivace. Výsledky pokusů byly statisticky zpracovávány v programu SAS 9.1 za pomoci parametrického testu ANOVA (t-test). Výsledky prokázaly, že SAC v jakékoli koncentraci neovlivnil průběh meiotického zrání po 24 ani po 48 hod. in vitro kultivace. Exprese proteinu Bcl-2 po 24 i 48 hod. kultivaci se SAC oproti kontrolní skupině kolísala v závislosti na přidaném množství SAC, v případě proteinu Bax klesla po 24 hod. i 48 hod. kultivaci. Výsledky 24 hod. kultivace oocytů se SAC prokázaly, že Bcl-2 a Bax jsou na sobě závislé a vyskytují se současně, popřípadě v heterodimerech. Po 24 hod. kultivaci se paralelní výskyt a překryv faktorů Bcl-2 a Bax oproti kontrole snížil, naopak po 48 hod. kultivaci stoupnul. Provedené experimenty potvrdily hypotézu, že SAC ovlivňuje expresi Bcl-2 a Bax a míru jejich výskytu a překryvu. Bylo by vhodné provést navazující experiment k objasnění distribuce proteinů z rodiny Bcl-2 na následný embryonální vývoj po in vitro oplození těchto oocytů.

Abstract:

Porcine oocytes are frequently used for in vitro cultivation due to their economic availability and easy retrieval. Quality of the oocytes is an essential factor in the field of reproductive biotechnologies and with the progress of these disciplines. Maturation and associated aging are naturally occurring processes in the oocyte. The main factor affecting their use for in vitro cultivation is a programed cell death, so-called apoptosis, which often happens due to an increase in production of reactive oxygen species. An intake of antioxidant molecules from the surrounding environment can counterbalance the detrimental effects. Among others, organic constituents of fresh garlic, especially S-Allyl cysteine (SAC), have high antioxidative effect lowering the apoptosis demonstration. Presented study is designed to assess the hypothesis of garlic sulphur compounds increasing the viability of maturing porcine oocytes by affecting the expression of apoptosis regulating factors. The aim was to prove the influence of SAC (0,1; 0,5 and 1,0 mM ) on the process of meiotic maturation and the expression of apoptotic factors in maturing porcine oocytes after 24 and 48 hours of cultivation. The data was statistically analysed by parametric ANOVA followed by t-test in SAS 9.1 software. The results show that SAC in any concentration does not affect the process of meiotic maturation after 24 or 48 hours of in vitro cultivation. Expression of Bcl-2 protein after 24 and 48 hours of cultivation with SAC varied, depending on the amount of added SAC, and the expression of Bax protein decreased after both 24 and 48 hours of cultivation with SAC. The data after 24 hours of co-cultivation of porcine oocytes wit SAC show that Bcl-2 and Bax are dependent on each other and appear simultaneously, or in the form of heterodimers. The parallel occurrence and overlap of Bcl-2 and Bax factors compared to a control group decreased after 24 hours incubation and increased after 48 hours of incubation. Performed experiments confirmed the hypothesis of SAC affecting the expression of Bcl-2 and Bax and the degree of their occurrence and overlap. It would be advisable to perform following experiments to determine the effect of the distribution of Bcl-2 protein on the embryonal development following in vitro fertilization of treated oocytes.

Keywords

Bcl-2, meiotické zrání, Bax, apoptóza, oocyt, S-allyl cystein

Keywords

meiotic maturation, S-allyl cysteine, Bax, oocyte, apoptosis, Bcl-2

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 4. 2015

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jan Nevoral, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction