Kvantifikace změn proteinových posttranslačních modifikací pomocí hmotnostní spektrometrie

Mgr. Hana Kuchaříková, Ph.D.

Doctoral thesis

Quantification of changes in protein post-translational modification status by mass spectrometry

Abstract:

Posttranslační modifikace histonových proteinů patří mezi epigenetické značky, které ovlivňují důležité procesy, včetně buněčného cyklu, genové exprese a proteinových interakcí. Pochopení epigenetických mechanismů eukaryotických buněk je velmi důležité nejen pro léčbu lidských onemocnění, ale i pro šlechtění za účelem vyššího výnosu rostlin. Hmotnostní spektrometrie je v současnosti jedna z hlavních technik používaných pro charakterizaci histonových modifikací. Analýzu histonových posttranslačních modifikací komplikuje množství histonových variant, kombinace a pestrost modifikací, zejména na N-koncové části proteinové sekvence bohaté na lysin a arginin. Přesto vývoj fungujících a spolehlivých hmotnostně spektrometrických metod postupuje. Například účinná derivatizace histonů se stala klíčovým předpokladem pro charakterizaci histonových modifikací pomocí "bottom-up" přístupu. Derivatizace nemodifikovaných aminových skupin je nezbytná pro dosažení reprodukovatelné digesce histonů s ArgC specifitou za použití trypsinu, navíc zlepšuje chromatografické retenční vlastnosti a separaci značených peptidů. Tato práce je zaměřena na optimalizaci postupů derivatizace histonů a jejich aplikaci za účelem sledování změn histonových modifikací u rostlin a savčích buněk za různých podmínek. Charakterizace rostlinných histonů byla usnadněna zavedením protokolu pro propionylaci aminových zbytků s použitím filtru, čímž bylo docíleno účinného značení společně s odstraněním kontaminací a zkrácením přípravy vzorku bez jeho zbytečných ztrát. Tato metoda byla použita pro rozsáhlou proteomickou charakterizaci histonových posttranslačních modifikací za účelem získání nových informací o vztahu mezi fenotypickými projevy a vzorcem histonových modifikací v rostlinách A. thaliana s redukovanou aktivitou histonových deacetyláz. Pro charakterizaci savčích histonů byla představena derivatizace anhydridem kyseliny trimethyloctové, která díky omezení koelucí izobarických peptidových forem umožnila identifikaci a kvantifikaci většího množství peptidů na základě hmotnostně spektrometrické analýzy prekurzorů. Větší zastoupení zcela naznačených peptidů navíc umožnilo kvantifikaci s lepší přesností a opakovatelností ve srovnání s hojně používaným anhydridem kyseliny propionové.

Abstract:

Post-translational modifications (PTMs) of histone proteins are epigenetic marks that influence crucial processes, including cell cycling, gene expression and protein interactions. The understanding of epigenetic mechanisms in eukaryotic cells is critically important for human medicine, but also for plant breeding to increase crop yields. Currently, mass spectrometry (MS)-based methods belong to the main approaches used for the characterization of histone modifications. Analysis of histone PTMs is challenging due to existence of numerous histone sequence variants with complex modification pattern, especially in lysine- and arginine-rich N terminal region of amino acid sequence. Yet, the development of reliable MS-based techniques is progressing. For instance, efficient histone derivatization becomes a prerequisite for successful characterization of histone PTMs by bottom up proteomics. The derivatization of unmodified amine groups ensures reproducible ArgC-like digestion of histones with trypsin and enhances chromatographic retention behaviour and separation of resulting peptides. This thesis is focused on optimization and application of histone derivatization protocols to monitor histone modification status under various conditions in plants and mammals. To facilitate plant histone characterization, protocol for propionylation of amine residues using filter unit was established, whereby efficient labelling was achieved together with contaminants removal, decreased sample preparation duration, and avoiding unnecessary sample loss. The approach was applied for comprehensive proteomic characterization of histone PTMs to obtain new information on the relationship between phenotypic features and the pattern of histone modifications in A. thaliana plants with abolished activities of histone deacetylases. For characterization of mammalian histones, trimethylacetic anhydride-based derivatization was introduced which due to reduced co-elution of isobaric peptide forms enabled identification and quantification of enhanced number of peptides at MS1 level. Moreover, an increased proportion of completely labelled peptides allowed superior quantification accuracy and reproducibility to widely used propionic anhydride.

Keywords

Histonové posttranslační modifikace, epigenetika, derivatizace, anhydrid kyseliny propionové, anhydrid kyseliny trimethyloctové, hmotnostní spektrometrie, LC\-MS/MS, kvantifikace bez použití značek Histone post\-translational modifications, epigenetics, derivatization, propionic anhydride, trimethylacetic anhydride, mass spectrometry, label\-free quantification

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 10. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 14. 12. 2021
• Supervisor: prof. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.
• Reader: doc. RNDr. Jiří Petrák, Ph.D., prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics