Modifikace nukleových kyselin pomocí redoxně značených nukleosidů a jejich voltametrická detekce

Bc. Zuzana Trošanová

Diplomová práce

Modification of Nucleic Acids by Redox-labeled Nucleosidess and Their Voltammetric Detection

Abstract:

This master thesis concerns with study of electrochemical behaviour of new DNA redox label 5'-(4-phenylazide)deoxyadenosine (dAPA) and DNA modified by triphosphates of dAPA (dAPATP) and 5'-(4-phenylazide)deoxycitidine (dCPATP) at mercury-aqueous electrolyte interface. An influence of electrolyte pH on dAPA reduction was observed by cyclic voltammetry at hanging mercury drop electrode (HMDE) in Britton – Robinson buffer as base electrolyte (pH 2-12) and limmits of detection (LOD) were found. Thanks to adsorption driven electrode porcess of dAPA at HMDE, which was confirmed by linear dependences of dAPA signal intensities on selected scan rates, an electro-analytical method for determination of dAPA was developed using adsorptive stripping voltammetry in BR buffer pH 5.0 and 7.0. This method allows to determine the dAPA with LOD 20 nM and 8 nM at pH 5.0 and 7.0, respectively. Selected number of electrochemical labels dAPA and dCPA (0, 1, 2, 3 and 4) were in form of triphosphates enzymatically incorporated into short DNA sequences (~30 nt) by primer extension techniques using DNA polymerases and terminal transferase. Possibility to incorporate higher number of dAPATP and dCPATP units into long DNA sequences (~360 nt) using PCR was successful in case of dCPATP. The 31 nt long oligonucleotide modified by 4 PA and PCR product with 88 PA units was posible to detect with LODs 1,0 pgμl-1 and 0,6 ngμl-1, respectively, using transfer stripping voltammetry at HMDE.

Abstract:

Tato diplomová práce se zabývá studiem elektrochemického chování nové elektrochemické DNA redox značky 5'-(4-azidofenyl)deoxyadenosinu (dAPA) a DNA modifikovaných pomocí trifosfátů dAPA (dAPATP) a 5'-(4-azidofenyl)deoxycitidinu (dCPATP) na rozhraní mezifází rtuť-vodný elektrolyt. Pomocí cyklické voltametrie byl zkoumán vliv pH na redukci dAPA na visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE) v Britton – Robinsově (BR) pufru jako základním elektrolytu (pH 2 – 12) a nalezeny limity detekce (LOD). Díky adsorpci řízenému elektrodovému procesu dAPA na HMDE, který byl potvrzen lineární závislostí výšek píku dAPA na rýchlosti polarizace elektrody, byla vypracována elektroanalytická metoda stanovení dAPA pomocí adsorptivní rozpoušťěcí voltametrie v BR pufru pH 5,0 a 7,0. Tato metoda možňuje stanovit dAPA s LOD 20 nM a 8 nM při pH 5,0 a 7,0. Vybrané počty elektrochemických značek dAPA a dCPA (0, 1, 2, 3 a 4) byly ve formě trifosfátů enzymaticky inkorporovány do krátkých DNA (~30 bazí) technikami prodlužování primeru pomocí DNA polymeráz a terminální transferázy. Možnost inkorporace většího počtu dAPATP a dCPATP jednotek do dlouhých DNA sekvencí (~360 bazí) pomocí PCR byla úspěšná v případě dCPATP. Metodou přenosové rozpouštěcí voltametrie na HMDE bylo možno stanovit 31 bazí dlouhý oligonukleotid modifikovaný 4-mi dAPA jednotkami s LOD 1,0 pgμl-1 a PCR produkt s 88-mi dCPA jednotkami s LOD 0,6 ngμl-1.

Klíčová slova

azidy, click reakcie, cyklická voltampérometria, elektrochémia, elektrochemické značky, nukleové kyseliny, PCR, predlžovanie primeru, prenosová technika, terminálna transferáza, 5'-(4-azidofenyl)deoxycitidín, 5'-(4-azidofenyl)deoxyadenozín azides, click reaction, cyclic voltammetry, electrochemistry, electrochemical labells, nucleic acids, primer extension, transfer technique, terminal transferase, 5'-(4-phenylazide)deoxycitidine, 5'-(4-phenylazide)deoxyadenozine

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 5. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 17. 6. 2015
• Vedoucí: RNDr. Aleš Daňhel, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Fyzika / Biofyzika