Vliv přídavku proteinových frakcí semenné plazmy na motilitu hřebčích spermií

Bc. Daniela Nová

Master's thesis

Influence of specific seminal plasma proteins addition on motility of stallions spermatozoa

Abstract:

Cílem této diplomové práce je prokázat, že přídavek proteinových frakcí semenné plazmy ke hřebčím spermiím před mražením, má vliv na jejich motilitu po rozmražení. Celá práce je zaměřena na motilitu již od samého začátku, tedy od kapitol anatomie a fyzilogie spermií.Sperma použité v experimentu bylo odebíráno standardním způsobem od šesti hřebců různého věku i plemene. Odebraný ejakulát byl naředěn ředidlem s kryokonzervačními látkami a z každého odběru bylo vytvořeno sedm pokusných alikvot – jedna kontrolní, tři s přídavkem heparin-vázající frakce proteinů semenné plazmy (HEP+) a tři s přídavkem heparin-nevázající frakce proteinů semenné plazmy (HEP-). Proteinové frakce byly přidány ve třech koncentracích - 125, 250 a 500 μg/ml. Takto připravené vzorky byly naplněny do polypropylenových pejet o objemu 0,5 ml, zamraženy a uchovávány v tekutém dusíku. Rozmraženy byly ve vodní lázni o teplotě 37 °C (30 sekund), následně byly naředěny na vhodnou koncentraci a ihned hodnoceny systémem CASA.Přídavek proteinových frakcí neměl signifikantní vliv na celkovou motilitu ani progresivní motilitu spermií, nicméně jednotlivé kinematické parametry motility spermií byly ovlivněny nejen přidanou frakcí HEP+ či HEP-, ale i jednotlivými koncentracemi. Náš experiment prokázal, že obě proteinové frakce mohou v určité koncentraci pozitivně ovlivnit kinematické parametry. Při porovnání obou frakcí a kontrolní skupiny bez rozlišení jednotlivých koncentrací, měly nejlepší hodnoty kinematických parametrů vzorky s přídavkem HEP- proteinové frakce. Spermie s HEP+ proteinovou frakcí měly ve dvou parametrech horší hodnoty než skupina s HEP-, ale i tak jejich výsledky byly lepší než u kontrolní skupiny. Frakce HEP+ měla v porovnání s kontrolní skupinou pozitivní účinky na pohyb spermií v koncentracích 125 μg/ml a 500 μg/ml, zatímco koncentrace 250 μg/ml měla účinky negativní. Frakce HEP- měla signifikantní pozitivní účinky v koncentraci 125 μg/ml, koncentrace 500 μg/ml měla srovnatelné výsledky s kontrolní skupinou a koncentrace 250 μg/ml způsobila ve většině kinematických parametrů zhoršení naměřených hodnot.Náš experiment se také zabýval individualitou jednotlivých hřebců, protože rozdíly v mrazitelnosti hřebčích spermií jsou značné. Vidament et al. (1997) a Hoffmann et al. (2011) uvádějí, že pouze 20 % hřebců produkuje ejakulát, který je možné mrazit bez výrazného snížení jeho kvality, a 20 – 50 % hřebců produkuje ejakulát, který naopak procesy mražení a rozmražení netoleruje. I naše výsledky prokázaly, že kinematické parametry motility spermií jsou u každého hřebce ovlivněny přídavkem proteinových frakcí semenné plazmy různým způsobem.

Abstract:

The goal of this thesis is to prove that addition of seminal plasma protein fractions to stallion spermatozoa before cryopreservation affects their motility after thawing. The focus of this thesis is on motility from the very beginning, that means from the sperm anatomy and physiology chapters.The sperm used in the experiment had been collected by standard collection method from six stallions of different age and breed. Collected ejaculates were diluted with extender containing cryopreservation chemicals and every collected ejakulate was divided into seven experimental patches – one control, three with addition of heparin-binding seminal plasma protein fraction (HEP+) and three with addition of heparin-non-binding seminal plasma protein fraction (HEP-). Protein fractions were added in three concentrations – 125, 250 and 500 μg/ml. Prepared patches were filled into 0.5 ml polypropylene straws, freezed and storaged in liquid nitrogen. After thawing (30 sec in 37 °C water bath) the batches were diluted to suitable sperm concentration and immediately assessed by CASA system.The addition of protein fractions did not significantly affect neither total sperm motility nor progressive sperm motility, but individual kinematic parameters of sperm motility were affected not only by adding protein HEP+ or HEP- fraction but also by used concetrations. Our experiment proved that both seminal plasma protein fractions can positively affect kinematic parameters of spermatozoa when used in correct concentration. Overall results of comparison of both protein fractions and control group showed that the best values of kinematic parameters reached batches with addition of HEP- protein fraction. Spermatozoa in batches with addition of HEP+ protein fraction showed lower values in two parameters in comparison to HEP- batches, but even though the results were better than values of spermatozoa in control batches. In comparison to the control group, HEP+ protein fraction showed positive effects on sperm motility when concentrations 125 μg/ml and 500 μg/ml were added, while in 250 μg/ml concentration the kinematic parameters of sperm motility were lower than in control batches. HEP- protein fraction showed significant positive effects in 125 μg/ml concentration, while 500 μg/ml concentration showed similar results like control group, and 250 μg/ml concentration had negative effect on most of the kinematic parameters of sperm motility.Our experiment also considered the individuality of the stallions, because the differences in sperm freezability are substantial. Studies Vidament et al. (1997) and Hoffmann et al. (2011) present as fact, that only 20 % of stallions are good freezers (their ejaculates are not negatively affected by freezing-thawing proceses) and 20 – 50 % of stallions are bad freezers (their ejaculates do not tolerate freezing-thawing proceses). Our results confirm that values of kinematic parameters of sperm motility varies greatly in response to addition of seminal plasma protein fractions among stallions.

Keywords

hřebec, motilita, semenná plazma, heparin-vázající proteinová frakce semenné plazmy, heparin-nevázající proteinová frakce semenné plazmy, spermie

Keywords

stallion, motility, seminal plasma, heparin-binding seminal plasma protein fraction, heparin-non-binding seminal plasma protein fraction, spermatozoa

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology