Nadměrná exprese proteinu SAMK fúzovaného s fluorescenčním proteinem a lokalizační studie

Mgr. Jiří SOJKA

Master's thesis

Overexpression of SAMK protein in fusion with fluorescence protein and localization study

Anotácia:

Rostliny jsou neustále vystavovány nepříznivým stimulům z vnějšího prostředí, které negativně ovlivňují jejich růst a vývoj. Jako určitá obrana proti těmto stresovým faktorům jim slouží MAP kinasová kaskáda. V této diplomové práci byly připraveny pomocí molekulárně biologických technik konstrukty SAMK ve fúzi s fluorescenčním proteinem a transformovány do Nicotiana benthamiana pro zjištění lokalizace za použití mikroskopie. Dále vytvořeny konstrukty Crispr/Cas9 SAMK gRNA a otestovány v Medicago sativa. Byly úspěšně vytvořené konstrukty 35S::SAMK:mRFP a 35S::mRFP:SAMK. Lokalizace SAMK-mRFP a mRFP-SAMK v buňkách listu N. benthamiana je v jádru nikoliv v jadérku a při cytoplasmatické membráně. Za pomocí metody Western blot byla ověřena produkce SAMK-mRFP a mRFP-SAMK v listech N. benthamiana. Rostliny M. sativa transformované konstrukty SAMK gRNA byly ověřeny pomocí PCR se specifickými primery a na transgen pozitivní byly dále analyzovány za použití Western blot. V M. sativa SAMK gRNA však docházelo napříč očekávání ke zvýšené tvorbě SAMK i dalších MAP kinas. Proto lze očekávat, že byl transgen pravděpodobně umlčen.

Abstract:

Plants are constantly exposed to adverse stimuli from the external environment, which negatively affect their growth and development. The MAP kinase cascade serves as a defense against these stressors. In this diploma thesis, constructs SAMK in fusion with a fluorescent protein were prepared using molecular biological techniques and transformed into Nicotiana benthamiana to determine the location using microscopy. Furthermore, the creation of Crispr/Cas9 SAMK gRNA constructs and their testing in Medicago sativa were performed. The 35S::SAMK:mRFP and 35S::mRFP:SAMK constructs were successfully generated. The localization of SAMK-mRFP and mRFP-SAMK in N. benthamiana leaf cells is in the nucleus and not in the nucleolus and also near to the cytoplasmic membrane. The production of SAMK-mRFP and mRFP-SAMK in N. benthamiana leaves was verified by Western blotting. Plants M. sativa transformed SAMK gRNA constructs were verified by PCR with specific primers and further transgene positive plants analyzed using Western blot. However, in M. sativa SAMK gRNA, the production of SAMK and other MAP kinases increased. Therefore, it can be expected that the transgene was probably silenced.

Kľúčové slová

MAP kinasa, SAMK, Crispr/Cas9, mikroskopie

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 6. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 7. 2020
• Vedúci: Mgr. Ivan Luptovčiak, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biochemistry / Biotechnology and Gene Engineering