Optimalizace Gibson assembly pro tvorbu polycistronních plasmidů určených k reprogramování somatických buněk do „medium spiny“ neuronů

Bc. Jáchym Brzezina

Master's thesis

Optimisation of Gibson assembly for construction of polycistronic vectors for somatic cell reprogramming into medium spiny neurons

Anotácia:

Tato diplomová práce se zaměřuje na vytvoření několika-genového DNA fragmentu ve formě lentivirového vektoru, který by mohl představovat nástroj umožňující transdiferenciaci astrocytů na neurony (konkrétně „medium spiny“ neurony). Následně by tohoto mohlo být využito při léčbě pacientů některých neurodegenerativních poruch spojených se ztrátou neuronů, například Huntingtonovy choroby. Teoretická část práce shrnuje různé metody spojování DNA fragmentů. Vzájemně je srovnává a popisuje jejich výhody a nevýhody. Praktická část pak využívá jednu z těchto metod, označovanou jako Gibson Assembly, která se jeví jako vhodná právě ke spojování několika delších DNA segmentů dohromady v rámci jediné izotermální reakce. První fáze experimentální části spočívala v optimalizaci PCR a docílení úspěšné a účinné amplifikace požadovaných genových fragmentů (s geny Mash1, Dlx2 a GFP), které mají být následně začleněny do vektoru, kterým byl plazmid pBOB. Následně byla provedena samotná Gibson Assembly, kterou však bylo nutné optimalizovat, aby byl získán požadovaný produkt. Ačkoliv se nepodařilo splnit hlavní cíl experimentu, bylo docíleno alespoň částečného úspěšného spojení genových segmentů. V poslední části diskuze je na základě těchto výsledků vyslovena hypotéza pro příčinu těchto problémů a navržena jejich možná řešení.

Abstract:

The diploma thesis focuses on the assembly of a multigene DNA construct in a form of a lentiviral vector, which could potentially be used as a tool for transdifferentiation of astrocytes into neurons (particularly the medium spiny neurons). This could then present a possible way of treating patients with some neurodegenerative diseases associated with loss of neurons, such as the Huntington’s disease. The theoretical part summarizes various methods of DNA assembly and compares their advantages and disadvantages. The practical part then utilizes one of them, referred to as the Gibson Assembly, which seems as a promising new way of assembling several longer DNA fragments together in a single isothermal reaction. First part of the experimentation involved PCR optimization and subsequent amplification of the desired gene fragments (genes Mash1, Dlx2 and GFP) to be connected and integrated in to the pBOB vector. Then, the actual Gibson Assembly was performed and optimized to obtain the desired product. The overall major aim of the experimentation was not fulfilled, but partial successful results were achieved and based on them a hypothesis for reasons behind the problems and their possible solution was given in the discussion section.

Keywords

Gibson Assembly, reprogramování, lentivirový vektor, Mash1, Dlx2, polycistronní plazmid, medium spiny neurony, reprogramming, lentiviral vector, polycistronic plasmid, medium spiny neurons

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 6. 2014
• Vedúci: Dr. Vladimír Pekařík

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics