Funkční analýza genetických variant v genech asociovaných s rozvojem glykotoxického poškození

Mgr. Katarína Chalásová, Ph.D.

Doctoral thesis

Functional analysis of genetic variants in genes associated with glycotoxic injury

Abstract:

Úvod. Diabetes mellitus je syndrom charakterizovaný hyperglykemií v důsledku absolutního či relativního deficitu inzulinu. Navzdory stále lepší diagnostice a terapii diabetu zůstává faktem, že pacienti všech forem diabetu jsou ohroženi rizikem sekundárního poškození cévního a nervového systému, ledvin a retiny. Souhrnně můžeme všechna tato s diabetem asociovaná poškození shrnout jako pozdní komplikace diabetu. (Ne)rovnováha mezi „glukotoxickými“ a potenciálně protektivními drahami může být jedním z faktorů interindividuální variability v rozvoji diabetických komplikací na podkladě hyperglykemie. Dizertační práce se zaměřuje na studium mechanizmů zodpovědných za hypotetickou (dys)funkci potenciálně protektivních drah v souvislosti se vznikem a progresí pozdních komplikací diabetu. Metody. Metodologicky bylo využito následujících přístupů: analýza vzorků periferní krve diabetických pacientů s různým stupněm poškození ledvin (studie typu „case-control“ s celkovým počtem 83 participantů a prospektivní studie s 343 participanty) a kultivace relevantních buněčných linií in vitro v diabetickém mikroprostředí. Konkrétně byla analyzována genová a proteinová exprese a aktivita transportérů a enzymů potenciálně protektivních drah a genetická variabilita v důležitých lokusech těchto drah. Výsledky. V in vitro studiích jsme prokázali zvýšení genové exprese enzymů pentózového cyklu a glyoxalázového systému – exprese byla zvýšená vlivem hyperglykemie, vitaminu D a zvýšené glukózové variability. V humánních studiích jsme prokázali vliv diabetu a onemocnění ledvin na funkci pentózového cyklu – u diabetiků jsme pozorovali zvýšení aktivity transketolázy a hladin kofaktoru thiamin difosfátu v porovnaní se zdravými kontrolami, toto zvýšení se ještě posílilo u diabetiků s poškozením ledvin. Prokázali jsme taky efekt genetické variability v některých lokusech zapojených do potenciálně protektivních drah na rozvoj a progresi diabetické nefropatie. Závěr. Výsledky dizertační práce naznačují, že rozvoj a progrese diabetických komplikací může být důsledkem snížené funkce protektivních drah jako pentózový cyklus. Ačkoliv jsme nezaznamenali významnější vzestup exprese jak thiaminových transportérů ani aktivačního enzymu TPK v podmínkách hyperglykemie, zdá se, že toto nebrání zvyšování aktivity TKT a tím PPP. Otázkou zůstává, zda je toto zvyšování aktivity dostatečné v kontextu glykotoxické zátěže, trvání diabetu a komorbiditám. Při současném renálním poškození je aktivita transketolázy dále zvyšována, což ukazuje na funkční PPP. Samotná hyperglykemie ovšem vysvětluje vznik diabetických komplikací jen částečně, k rozvoji a/nebo progresi diabetické nefropatie mohou významným podílem přispívat i glukózová variabilita a genetické polymorfizmy protektivních enzymů.

Abstract:

Background. Diabetes mellitus is a syndrome characterized by hyperglycaemia resulting from an absolute or relative insulin deficiency. Despite continuously improving diagnosis and therapy diabetics (both type 1 and 2) are at risk of secondary damage of the vascular and nervous system, the kidneys and retina (collectively denoted as a late diabetic complication). (Im)balance between „glycotoxic“ and supposedly protective pathways may be one of the factors contributing to interindividual variability in the onset and progression of diabetic complications triggered by hyperglycaemia. The studies collated within PhD thesis focus on the understanding of mechanisms responsible for putative (dys)function of the potentially protective pathways contributing to the development and progression of late diabetic complications. Methods. Methodological approach consisted of: analysis of peripheral blood samples of diabetic patients with various degrees of kidney disease (with case-control study comprising n = 83 and follow-up cohort study n = 343 subjects) and cultivation of relevant cell lines in vitro in diabetic microenvironment. We specifically focused on the analysis of gene and protein expression and activity of transporters and enzymes of potentially protective pathways and genetic variability in important loci of these pathways. Results. In vitro studies revealed increase of gene expression of enzymes of pentose phosphate pathway and glyoxalase system due to hyperglycaemia, vitamin D exposure and high glucose variability. In human studies, we have demonstrated effect of both diabetes and kidney function on the pentose phosphate pathway parameters – diabetic patients exhibited increased activity of transketolase and thiamine diphosphate levels compared to healthy controls, the increase being even higher in diabetics with kidney dysfunction. We also demonstrated the effect of genetic variability in selected loci related to potentially protective pathways in the development and progression of diabetic nephropathy. Conclusions. Our results suggest that the development and progression of diabetic complications may be due to decreased function of protective pathways like pentose phosphate pathway. We were unable to ascertain a significant increase in the expression of neither thiamine transporters nor enzyme TPK in hyperglycaemic conditions. Although this does not seem to prevent raise of TKT and PPP activity, the question remains, whether this activity is sufficient to prevent damage in glycolytic environment, during entire duration of diabetes and in the context of other comorbidities. In the presence of renal damage, TKT activity raises further indicating the functionality of PPP preserved. Hyperglycaemia itself explain the variability in the development of diabetic complications (diabetic nephropathy namely) only to some extent though suggesting other factors such as glucose variability or genetic polymorphisms of protective enzymes can operate as well.

Keywords

diabetes mellitus, glukotoxicita, hyperglykemie, diabetická nefropatie, chronické onemocnení ledvin, dikarbonylový stres, oxidační stres, pentózový cyklus, glyoxalázový systém, glukózová variabilita, thiamin, transketoláza, glukotoxicity, diabetic nephropatie, chronic kidney disease, dicarbonyl stress, oxidative stress, pentose phosphate pathway, glyoxalase system, glucose variability, thiamine, transketolase

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 2. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 31. 3. 2017
• Supervisor: prof. MUDr. Kateřina Kaňková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Physiology and Pathological Physiology (4-years) / Physiology and Pathological Physiology