Biodetekční systémy v hodnocení endokrinně disruptivního potenciálu látek v povrchových vodách

Mgr. Jakub Javůrek, Ph.D.

Doctoral thesis

Biodetection systems in the assessment of endocrine disrupting potential of compounds in surface waters

Abstract:

Práce se zaměřuje na látky v akvatickém prostředí se schopností narušit přirozené fungování endokrinního systému organismů. Tyto se běžně vyskytují ve velice komplexních směsích, a to i v prostředí zkoumaných povrchových vod. Chemická analýza dokáže sledovat koncentrace jednotlivých chemických látek, nedokáže však zhodnotit míru nebezpečnosti směsi a jejího vlivu na živé organismy. Potenciál látek či směsí působit negativně na hormonální rovnováhu (tzv. endokrinní disrupce) lze sledovat s využitím biodetekčních systémů in vitro, které jsou zvláště užitečné při testování komplexních vzorků z prostředí, kde charakterizují výslednou odpověď všech látek ve směsi. Biodetekční systémy byly v rámci této práce použity pro testy vzorků z ekosystémů povrchových vod. Výsledky byly diskutovány propojením s ostatními přístupy, zejména s výsledky chemických analýz a in vivo testů na celých organismech. Tři studie se postupně zaměřily na méně známé aspekty endokrinní disrupce: I) estrogenní účinek látek pocházejících z rostlin, plísní a fytoplanktonu vyskytujících se ve vodách, II) obsah estrogenních látek v zelených řasách a sinicích a III) retinoidní působení látek produkovaných jedním z nejrozšířenějších druhů sinic, Microcystis aeruginosa, a vodními květy s jeho dominancí. První studie shrnuje informace o fyto- a mykoestrogenech, estrogenních látkách produkovaných rostlinami a plísněmi. Popisuje jejich hlavní typy, zdroje a vstupy do vodního prostředí. Jako jeden z dosud přehlížených možných zdrojů přirozených estrogenních látek ve vodním prostředí uvádí fytoplanktonní organismy. Pro odhad možného příspěvku známých fyto/mykoestrogenů k estrogenní aktivitě povrchových vod byly koncentrace jimi produkovaných látek naměřených chemickými metodami vynásobeny jejich relativními potencemi zjištěnými v in vitro biotestech. Vypočtené výsledky ukázaly obecně nízký příspěvek fyto/mykoestrogenů k celkové estrogenní aktivitě většiny povrchových vod, avšak v několika oblastech s jejich velmi vysokou koncentrací byl příspěvek významný. Obdobné výsledky ukázala i literární rešerše jejich možného negativního působení in vivo. Studie in vivo byly dostupné pouze pro šest fytoestrogenů a jeden mykoestrogen vyskytující se ve vodním prostředí a organismy použité pro testování byly pouze zástupci ze skupiny ryb. Ačkoliv většina studovaných povrchových vod obsahovala sledované látky v koncentracích nižších, než jsou jejich známé in vivo efektivní koncentrace, na několika lokalitách byla tato hodnota značně překročena. Ve druhé studii byla sledována celková estrogenita extraktů z biomas různých druhů fytoplanktonu, a to jak biomas získaných z prostředí, tak i z laboratorních kultivací. Pro lepší pochopení účinků těchto extraktů ve směsích s dalšími kontaminanty povrchových vod, byly tyto extrakty testovány také v přítomnosti standardního estrogenu 17β-estradiolu, který bývá v povrchových vodách běžně detekován. Estrogenita extraktů z biomasy získané v terénu byla srovnatelná s výsledky z biomasy jednotlivých druhů kultivovaných v laboratoři. Většina extraktů neměla žádný pozorovatelný estrogenní účinek, a pokud ano, tak byl relativně nízký. Jeho případný environmentální význam by se tak dal očekávat pouze v ekosystémech značně zatížených vodními květy, kde by již docházelo k jiným závažným projevům, jako jsou např. následky poklesu obsahu kyslíku a produkce cyanotoxinů. Testování společného účinku látek z vodních květů s estradiolem naznačuje, že při koncentraci estradiolu, která se v prostředí může běžně vyskytovat, dochází k aditivnímu spolupůsobení. Při společné expozici vzorku

Abstract:

s vysokou koncentrací estradiolu bylo u některých extraktů zaznamenáno částečné antiestrogenní působení in vitro. Třetí studie se zaměřuje na retinoidní aktivitu a retinové kyseliny, které hrají významnou roli během vývoje obratlovců. Je to první práce, která zkoumá celkovou retinoidní aktivitu vzorků z prostředí vodních květů sinic. Vzorky biomasy i okolní vody byly odebírány ze sedmi vodních nádrží, zejména rybníků a přehrad, ve kterých byl vodní květ s převážným zastoupením sinice Microcystis aeruginosa. Tyto vzorky byly analyzovány jak chemickou analýzou, tak in vitro biotesty. Stejným postupem byly testovány i vzorky z laboratorní kultivace M. aeruginosa. Ve všech vzorcích z biomas napříč testovanými lokalitami, i z laboratorních kultivací, byla prokázána významná retinoidní aktivita. Spolu s výsledky z opakovaných odběrů ze stejné lokality v různých časech toto ukazuje, že retinoidně aktivní látky bývají v sinici M. aeruginosa přítomny v relativně stabilní koncentraci. Retinoidní aktivita okolní povrchové vody byla detekovatelná jen u tří z dvanácti testovaných vzorků z terénu. Ve všech typech vzorků byl detekován cyanotoxin microcystin, ten však neměl žádný retinoidní účinek in vitro. Ve většině vzorků byla celková retinoidní aktivita vyšší než lze předpokládat z naměřených koncentrací dvou analyzovaných retinových kyselin, konkrétně kyseliny all-trans retinové a 9-cis retinové, což poukazuje na přítomnost dalších látek s retinoidní aktivitou. Škodlivé působení těchto látek by se mohlo projevit v prostředí, zejména pak v menších vodních nádržích s rozvinutým vodním květem, kde jím produkované látky nejsou dostatečně vyředěny. V disertační práci byla využita kombinace informací získaných in vitro modely, chemickými analýzami a in vivo studiemi, což umožnilo citlivou detekci, charakterizaci a pochopení potenciálu zkoumaných laboratorních a terénních vzorků působit endokrinní disrupci sledovanými mechanismy a efektivně zaměřit další výzkum.

Abstract:

The thesis focuses on the compounds in aquatic environment with the ability to disturb functions of endocrine system of organisms. They are generally found in very complex mixtures in the environment including investigated surface waters. Chemical analysis enables to detect concentrations of selected individual compounds, but it does not provide information on the overall hazard and the joint influence of the compounds present in mixtures. Therefore, biodetection systems (specific in vitro assays) were used as sensitive tools to assess the endocrine disrupting potential of tested environmental mixtures. The results were discussed also with information from other methods, mainly chemical analyses, in vivo testing and modelling. Three separate studies focused on rarely investigated aspects of endocrine disruption were conducted; namely I) on the estrogenicity of compounds naturally produced by plants, moulds or phytoplankton occurring in surface waters, II) on the overall estrogenic activity of compounds in green algae and cyanobacteria biomass and III) on the retinoid-like activity of compound mixtures produced by one of the most abundant cyanobacteria Microcystis aeruginosa and water blooms with its dominance. The first study reviews information about phytoestrogens and mycoestrogens, natural compounds present in fresh waters. Main types, sources, and pathways of entry into aquatic environment of the known phyto/mycoestrogens were summarized and phytoplankton was indicated as one of the possible unidentified sources of these compounds. To evaluate whether the phyto/mycoestrogens can substantially contribute to in vitro estrogenic activity of fresh waters, their detected concentrations were multiplied by their relative potencies for a large number of in vitro systems. The results showed low contribution of phyto/mycoestrogens to estrogenic activity in most surface waters, but significant contribution to in vitro responses in areas with high concentrations of some compounds. Similar results were obtained for evaluation of potential in vivo effects of these compounds. In vivo effective concentrations of waterborne phyto/mycoestrogens were available for only six phytoestrogens and one mycoestrogen and the only tested organisms were fishes. While majority of investigated surface waters contained concentrations of phyto/mycoestrogens lower (mostly nondetected) than the known in vivo effective concentrations, these effective concentrations were highly exceeded at few places. The second study examined the overall estrogenicity of biomasses extracts of wide spectra of phytoplankton species occurring in environmental waters as well as cultivated in laboratories. These extracts were also co-exposed with commonly occurring estrogen 17β-estradiol to investigate the mixture interactions. The estrogenicity of environmental and cultivated phytoplankton samples was highly comparable. Majority of extracts elicited no detectable estrogenic activity and the detected estrogenic potential was relatively low and could be of environmental relevance only in waters with massive water blooms where other more severe effects can be expected due to oxygen depression or toxin production. Regarding the mixture interactions, the co-exposure of the extracts with environmentally relevant concentration of estradiol demonstrated simple additivity. When the biomasses extracts were co-administered with higher concentrations of 17β-estradiol, some extracts behaved as partially antiestrogenic in vitro. The third study was focused on retinoid-like activity and retinoic acids, as these play a critical role in vital physiological processes in vertebrate development. It was the first study to investigate field water bloom samples for their total retinoid-like activity. Seven individual reservoirs with water blooms dominated by widely abundant cyanobacterium Microcystis aeruginosa were sampled, biomass and water extracted and measured by chemical as well as in vitro ana

Abstract:

lyses. The results were compared with results of the same procedure applied on M. aeruginosa strain cultivated in laboratory. Significant retinoid-like activity was detected in biomass extracts from all sampled reservoirs as well as in all extracts of biomasses from laboratory cultivations. The results together with activities measured at different times during water bloom season imply that compounds with retinoid-like activity are present in M. aeruginosa cells at relatively stable levels. Only three out of twelve surrounding water samples exhibited detectable retinoid-like activity. Microcystins were detected in all types of samples, but they elicited no detectable retinoid-like activity. In most samples, all-trans retinoic acid and 9-cis retinoic acid contributed relatively little to the total retinoid-like activity, which indicates the presence of significant amounts of other compounds with retinoic acid receptor-mediated modes of action. The impact of retinoid-like cyanobacterial metabolites could be of importance namely in smaller water bodies with dense water blooms and low dilution. Throughout the thesis, combination of information from in vitro assessment, chemical analyses and in vivo studies enabled sensitive detection, characterization and understanding of endocrine disrupting potential of investigated laboratory and environmental samples and helped to efficiently focus future research.

Keywords

cyanobacteria, in vitro biodetection, endocrine disruption, nuclear receptor, harmful algal blooms, surface water, retinoid-like activity, in vitro biodetekce, endokrinní disrupce, sinice, jaderný receptor, vodní květy, povrchová voda, retinoidní aktivita

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 24. 6. 2019
• Supervisor: doc. Mgr. Klára Hilscherová, Ph.D.
• Reader: Ing. Hana Kocour Kroupová, Ph.D., prof. MVDr. Zdeňka Svobodová, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Ecotoxicology