Využití luminometrických metod při sledování vrozené imunity živočichů

Mgr. Libor Vojtek, Ph.D.

Doctoral thesis

Usage of luminometric methods in animal innate immunity studies

Abstract:

Luminiscence, tedy produkce světelného signálu přeměnou elektromagnetické, chemické, elektrické či mechanické energie, je důležitým fyzikálním jevem využívaným v mnoha biologických či chemických metodách. Bioluminiscenční organismy představují fascinující objekty zájmu nejen obyčejných lidí, ale především vědců zabývajících se tímto fenoménem. Asi nejznámějším živočichem schopným produkce světla je světluška, avšak drtivá většina bioluminiscenčních organismů žije ve vodním prostředí, včetně nejpočetnější skupiny - bioluminiscenčních bakterií. Pro účely této práce byly vybrány dva druhy bakterií, a to přirozeně svítící Photorhabdus luminescens a geneticky modifikovaná Escherichia coli K12, která nese multikopie plasmidů obsahujících geny pro bakteriální luciferázu a její substráty původně pocházející z P. luminescens. Obě bakterie produkují světelný signál díky oxidaci substrátů, aldehydu s dlouhým řetězcem a flavin mononukleotidu, katalyzované enzymem luciferázou. Tvorba těchto substrátů probíhá pouze za spotřeby energie produkované živými buňkami, což znamená, že bioluminiscence je přímo úměrná viabilitě bakterií. Tohoto jevu využívají antibakteriální měření založená na poklesu bioluminiscenčního signálu po přidání jakékoliv látky s antibakteriálními účinky k suspenzi bakteriální kultury. Práce popisuje optimalizační experimenty znázorňující podmínky kultivace, teplotní optimum, závislost počtu bakterií na optické hustotě suspenze či reakce jednotlivých bakterií na přítomnost systému peroxid vodíku/myeloperoxidáza. Studie 1, 2 a 5 popisují zavedení a využití popsaných metod při měření některých parametrů vrozené imunity živočichů, tedy antibakteriální aktivity lidského komplementu a hemolymfy hmyzu (především antimikrobiálních peptidů), a navíc také vliv rostlinných extraktů. Vrozené imunitní pochody využívají k zabíjení bakterií a dalších patogenů infiltrovaných do nitra organismu účinnou zbraň v podobě reaktivních metabolitů kyslíku a dusíku. Pokud se tyto molekuly vymknou kontrole, či jejich produkce jednoduše přesáhne únosnou koncentraci, mohou poškozovat molekuly tělu vlastní a nastává tak oxidační stres. Oxidační stres hraje významnou roli při iniciaci závažných onemocnění, jako jsou nemoci kardiovaskulárního systému, rakovina či Alzheimerova choroba. Pro odstranění oxidačního stresu je zapotřebí látek s redukčním potenciálem, tzv. antioxidantů. Jejich příjem v potravě hraje hlavní roli při ochraně proti oxidačnímu stresu. Existuje několik metod měřících antioxidační kapacitu biologických vzorků, patří mezi ně i metoda TRAP (Total Radical trapping Antioxidant Parameter) založená na eliminaci peroxylových radikálů antioxidanty přítomnými ve vzorcích. Pokud tyto radikály nejsou inhibovány, oxidují přítomný luminol, jež produkuje světelný signál měřitelný luminometrem. Nejvíce antioxidantů je obsaženo v ovoci či zelenině, ale zatím neexistuje velké množství studií zabývajících se obsahem jednotlivých antioxidantů v rostlinách. Studie 4 a 5 popisují měření antioxidační kapacity rostlinných extraktů pomocí 4 metod (včetně TRAP) spolu s jejich antibakteriálními účinky a s vlivem na produkci reaktivních metabolitů kyslíku fagocyty. Výsledky ukazují na rostliny, z nichž by měla být připravována funkční jídla pro posílení příjmu antioxidačních látek. Metoda TRAP byla použita také ve studii 3, jež se zabývá adaptivní fylogeografií norníka rudého a především jeho osidlováním Británie na konci poslední doby ledové. Z výsledků vyplývá, že při tomto osidlování hrála velkou roli mutace zvýhodňující nově příchozí populaci v lepší antioxidační ochran

Abstract:

ě molekuly hemoglobinu. Antioxidační kapacita hemolyzátu byla měřena metodou TRAP, jež umožnila funkční ověření teoretické hypotézy. Tato studie ukazuje na důležitost ověření funkčnosti produktů jednotlivých genů označených za molekulární markery odpovědné za selekční procesy kolonizace. Výsledky všech experimentů obsažených v této práci mohou v budoucnu napomoci např. řešení otázek narůstající bakteriální antibiotické resistence či při prevenci chorob kardiovaskulárního systému spojené s příjmem dostatečného množství antioxidantů v potravě.

Abstract:

Luminescence - light signal production by conversion of electromagnetic, chemical, electric or mechanical energy - is an important physical phenomenon used in many biological or chemical methods. Bioluminescence organisms present fascinating objects of interest not only to public but scientists above all. Most famous and also well studied bioluminescent animal is firefly; however majority of bioluminescent organisms live in an aquatic environment including the most numerous group - bioluminescent bacteria. Two species of bioluminescent bacteria were chosen for the purposes of this work, namely the naturally luminous Photorhabdus luminescens and genetically modified Escherichia coli K12 carrying multicopy plasmids containing genes for bacterial luciferase and its substrates originating from P. luminescens. Both bacterial species produce bioluminescent signal via oxidation of substrates, long chain aldehyde and flavin mononucleotide, catalyzed by luciferase enzyme. Production of these substrates consume a lot of energy which is produced only by living cells, which means that bioluminescent signal is equal to the bacterial viability. This effect utilizes antibacterial assays based a on decrease of the luminescent signal after addition of any antibacterial material to the bacterial suspension. This thesis presents optimization experiments that illustrate optimal cultivation conditions, the temperature optimum, dependence of the optical density on the bacterial cell number in the suspension, or reaction of both the bacterial species to hydrogen peroxide/myeloperoxidase system. Study 1, 2 and 5 describe the introduction and usage of the described methods on measurements of certain innate immunity factors, such as human complement system and insect haemolymph (mostly antimicrobial peptides), and moreover the influence of plant extracts. Innate immunity processes are using very efficient weapon in the form of reactive oxygen species to kill bacteria and other pathogens infiltrating the organism. Once these molecules are out of control or their production exceeds the marginal concentration, they attack own body molecules, which causes the oxidative stress. The oxidative stress plays a crucial role in initiation of numerous serious diseases such as cardiovascular diseases, cancer or the Alzheimer’s disease. To avoid the oxidative stress, reduction molecules called antioxidants are needed. Nutrition intake of antioxidants plays an essential role in the oxidative stress protection. There are several methods of measuring antioxidant capacity of the biological samples including the TRAP method (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter), which is based on peroxyl radical elimination by antioxidants presented in the samples. If these antioxidants are not inhibited, they oxidise present luminol, which produces a light signal measured by luminometer. Huge amount of the antioxidants are included in fruits or vegetables, but there are not many studies dealing with the antioxidant content in plants yet. Study 4 and 5 present the antioxidant capacity of plant extracts measurements using 4 methods (including TRAP), together with their antibacterial properties and impact on the reactive oxygen species production by phagocytes. The results point on the plants which should be used for the preparation of functional foods to strengthen the intake of antioxidants. Study 3 presents the adaptive phylogeography of bank vole and first of all its settlement in Britain at the end of the last glacial. The results point out, that the mutation favouring a new incoming population in a better antioxidant protection of haemoglobin molecule played a significant role during the colonization. The antioxidant capacity of hemolysate measured by TRAP enabled a functional examination of theoretical hypothesis. This study shows the importance of genes (selected as molecular markers) products function examination. The results of the experiments contained in this thesis

Abstract:

may in the future help resolve the bacterial antibiotic resistance problem, or be helpful in prevention of cardiovascular diseases by sufficient nutrition intake of antioxidants.

Keywords

bioluminiscence, Photorhabdus luminescens, Escherichia coli K12, antimikrobiální peptidy, komplementový systém, oxidační stres, antioxidanty, TRAP bioluminescence, antimicrobial peptides, complement system, oxidative stress, antioxidants, TRAP

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 10. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 31. 10. 2014
• Supervisor: doc. RNDr. Pavel Hyršl, Ph.D.
• Reader: RNDr. Petr Šíma, CSc., Mgr. Martina Bancířová, Dr.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology