Biologické vlastnosti původců nákaz včel a jejich využití v mikrobiologické diagnostice

Mgr. Jana BIOVÁ

Master's thesis

Biological properties of the causative agents of bee diseases and their using in microbiological diagnostics

Abstract:

Mor včelího plodu (původce Paenibacillus larvae) a hniloba včelího plodu (původce Melissococcus plutonius) jsou významná onemocnění včel, které jsou v souladu s Veterinárním zákonem č. 166/1999 Sb. ve znění pozdějších předpisů řazena mezi nebezpečné nákazy včel. Obě onemocnění jsou vyvolána bakteriálními původci a způsobují velké problémy včelařům po celém světě. V posledních letech byla zjištěna řada rozdílů v průběhu onemocnění morem včelího plodu v závislosti na genotypu původce onemocnění určeném dle ERIC primerů. Byly objeveny 4 základní genotypy P. larvae označené ERIC I-IV, kdy první dva genotypy jsou podle prozatím dostupných informací běžné, zatímco genotypy ERIC III a ERIC IV jsou vzácné. V současnosti využívaná diagnostika hniloby včelího plodu zahrnuje kultivaci původce tohoto onemocnění z infekčního klinického materiálu, potravin, surovin živočišného původu a prostředí. Díky pomalému růstu a nutnosti anaerobní kultivace je tento postup nejen náročný, ale hlavně velmi zdlouhavý. Doporučená doba kultivace M. plutonius je 7 dní. Diplomová práce zahrnuje optimalizace PCR genotypizace P. larvae dle primerů ERIC a také optimalizovaný protokol PCR detekce M. plutonius ve včelí měli a medu. Výsledky poskytují nové informace o rozšíření genotypů P. larvae na území České republiky. Podařilo se určit genotyp u 102 terénních kmenů P. larvae, z nich 20 bylo identifikováno jako ERIC I a 82 jako ERIC II. Oblasti výskytu ERIC I jsou zejména okresy Český Krumlov a Jeseník. Nejhojnější výskyt ERIC II byl zaznamenán v okresech Olomouc a Zlín. Během optimalizace identifikace M. plutonius bylo vyzkoušeno několik přístupů, výsledné protokoly kombinují použití speciálně navržených příprav vzorku s následnou izolací DNA pomocí DNeasy Plant Mini Kitu a amplifikaci vybraných úseků DNA pomocí optimalizovaného protokolu PCR s použitím FastStart Taq DNA Polymerase. Protokoly umožňují identifikaci M. plutonius v úlové měli a medu, přičemž je možno spolehlivě identifkovat přítomnost již 105 bakterií v gramu měli a medu, nižší množství bakterií mohou poskytovat falešně negativní výsledky. Metodika byla zavedena na laboratorně kontaminovaných vzorcích mělí a medů. Výhodou PCR detekce je kratší doba při identifikaci původce v biologickém materiálu, metoda poskytuje také potenciální možnost plošného monitoringu výskytu bakterie na včelnicích bez nutnosti odběru plodových plástů. Diplomová práce déle obsahuje prvotní výsledky optimalizace kultivačního média pro M. plutonius s výsledkem testů dvou běžně užívaných kultivačních médií, kdy médium M110 poskytovalo lepší výsledky.

Abstract:

American foulbrood (causative agent Paenibacillus larvae) and European foulbrood (causative agent Melissococcus plutonius) are important bee diseases, which are in accordance with the Veterinary Act No. 166/1999 Coll. as amended classified as dangerous bee infections. Both diseases are caused by bacterial agents and both diseases generate big issues all over the world. Recently, a number of differences were discovered depending on ERIC genotype. There are 4 ERIC genotypes of P. larvae named as ERIC I-IV. The first two genotypes are commonly spread, while ERIC III and ERIC IV genotypes are rare. The currently used diagnostic methods of European foulbrood are based on isolation and cultivation of the biological agent from various biological materials, e.g. food, raw materials of animal origin, hive environmental material etc. Cultivation of M. plutonius is slow and needs anaerobic condition. The recommended time of M. plutonius cultivation is 7 days. The diploma thesis includes the optimization of PCR genotyping of P. larvae according to ERIC primers as well as the optimized PCR detection protocol of M. plutonius in hive debris and honey. The results show a new information considering P. larvae genotypes in the Czech Republic. P.larvae was identified in 102 field samples. ERIC I or II genotypes were identified in 20 and 82 cases, respectively. Districts of ERIC I occurrence are Český Krumlov and Jeseník. The most cases of ERIC II were founded in Olomouc and Zlín. Several approaches have been done during optimization of M. plutonius identification. Resulting protocols use specially designed sample preparation followed by DNA isolation with DNeasy Plant Mini Kit and amplification of selected DNA segments using an optimized PCR protocol with FastStart Taq DNA Polymerase. Protocols allow the identification of M. plutonius in hive debris and honey. It is possible reliable identify presence of 105 bacteria in 1 gram of debris or honey. Lower amount of bacteria can produce false negative results. The methodology was created on laboratory-enriched samples of debris and honey. The advantage of PCR detection without microbiological cultivation is a shorter time of bacterial identification. It also provides a potential for M. plutonius monitoring in a field without samplig brood frames from suspected colonies. The diploma thesis contains the initial results of the optimization of the culture medium for M. plutonius with the result of tests of two commonly used culture media. The M110 medium provided better results.

Keywords

Mor včelího plodu, Hniloba včelího plodu, Paenibacillus larvae, Melissococcus plutonius, ERIC PCR, diagnostické metody.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 28. 5. 2018
• Supervisor: MVDr. Jaroslav Bzdil, PhD.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry