Vývoj plazmidů - interakce plazmidů rezistence a virulence u Salmonella enterica

Mgr. Tereza Kubasová, Ph.D.

Doctoral thesis

Evolution of plasmids - interaction plasmids resistance and virulence in Salmonella enterica

Abstract:

Pro šíření antibiotické rezistence má důležitý význam především horizontální přenos genů rezistence na plazmidech. V současné době jsou u patogenních bakterií stále častěji nalézány vysokomolekulární plazmidy nesoucí geny rezistence k antibiotikům či jiným inhibitorům růstu. Navíc u plazmidů rezistence dochází také k interakcím s jinými plazmidy, které zodpovídají a/nebo zvyšují virulenci bakteriálního kmene k hostiteli. V této práci jsem se proto zaměřila na oba tyto jevy. V první části práce jsme stanovili kompletní nukleotidovou sekvenci plazmidu p9134 a jeho dvou variant p9134dT a p9134dAT, které spontánně ztratily, buď rezistenci k tetracyklinu, nebo k tetracyklinu a ampicilinu. Plazmidy dosahovaly velikosti 133 802 bp, 127 291 bp a 109 512 bp. Jejich základní struktura byla podobná ostatním plazmidům IncI skupiny. U plazmidu p9134 se potvrdila přítomnost genů rezistence k ampicilinu (blaTEM), chloramfenikolu (catA1), streptomycinu (strA, strB), tetracyklinu (tetA (A)) a gentamycinu (aac(3)-IV). Kromě těchto genů byly nově nalezeny geny rezistence k hygromycinu (hph) a hypotetický gen pro rezistenci k apramycinu. V p9134dAT nebyla nalezena oblast kódující rezistenci k ampicilinu, hygromycinu, apramycinu, gentamicinu a tetracyklinu. Genetické přeskupení v p9134dT bylo složitější, jelikož došlo ke dvěma rekombinačním událostem. V první z nich byla oblast obsahující geny rezistence k hygromycinu, apramycinu, gentamicinu a tetracyklinu nahrazena geny rck, srgB, srgA, orf7 a pefI pocházejícími z plazmidu virulence pSLT sérovaru Salmonella Typhimurium. V průběhu druhé rekombinace byly nahrazeny geny ydjA, pifA a repC z p9134 geny repA2, PSLT025 a PSLT026 z pSLT. Tyto výsledky ukazují, že rekombinace mezi nepříbuznými plazmidy mohou být zcela běžné a mohou vést k vzniku plazmidů nesoucích zároveň geny rezistence k antibiotikům a geny zvyšující virulenci hostitele. V druhé části práce jsem se zabývala plazmidy skupiny IncHI1, které hrají důležitou roli v přenosu antibiotické rezistence u Salmonella Typhimurium. Stanovili jsme kompletní nukleotidové sekvence čtyř IncHI1 plazmidů nesoucích geny rezistence k antibiotikům. Největší plazmid p8025 dosahoval velikosti 311 280 bp, plazmid pF8475 210 266 bp, p109-9 207 203 bp a pB71 190 730bp. Kromě nukleotidových sekvencí byla pomocí hmotnostní spektrometrie stanovena exprese genů nesených těmito plazmidy. Sekvenační data zahrnovala také sekvence 11 plazmidů skupiny IncHI1 z databáze GenBank, které byly použity pro stanovení core-genomu a pan-genomu této skupiny plazmidů. Core-genom se skládal ze 123 kb a pan-genom dosahoval téměř 600 kb. Na základě porovnání core-genomových sekvencí se plazmidy rozdělily do dvou hlavních vývojových linií. Podíl GC se pohyboval kolem 46 % v genech náležících do core-genomu a kolem 50 % u doplňkových genů. Oblast obsahující geny rezistence zahrnovala u všech čtyř sekvenovaných plazmidů přes 20 kb a s výjimkou genu tetB, všechny geny kódující antibiotickou rezistenci měly zvýšený obsah GC. Z toho usuzujeme, že IncHI1 plazmidy představují replikony, které se vyvinuly v bakteriích s nižším GC obsahem. Z původního hostitele se šířily do salmonel a během šíření získávaly tyto plazmidy další geny, například geny rezistence k antibiotikům. Tyto geny patřily mezi nejvíce exprimované plazmidové geny a byly podstatně exprimovány i v nepřítomnosti antibiotik, což je pravděpodobně mechanismus, díky kterému jsou buňky hostitele schopny přežívat v případě, že se v prostředí náhle vyskytnou antibiotika.

Abstract:

Gene transfer mediated by plasmids plays an important role in the spread of antibiotic resistance genes. Nowadays, high molecular weight plasmids carrying resistance genes to antibiotics and growth inhibitors are commonly found in pathogenic bacteria. Moreover, conjugative plasmids coding for antibiotic resistance may interact with virulence plasmids thus resulting in plasmid transferring both antibiotic resistance and virulence genes. In this thesis I therefore pursued genomics and proteomics studies on plasmids of two incompatibility group. In the first part of the thesis we determined the complete nucleotide sequences of multidrug resistance plasmid p9134 and its two variants, p9134dT which spontaneously lost tetracycline resistance gene, and p9134dAT which spontaneously lost ampicillin and tetracycline resistance genes. Plasmids were 133 802 bp, 127 291 bp a 109 512 bp in size, respectively, and their basic backbone was similar to that of IncI plasmids. In plasmid p9134 genes coding for ampicillin (blaTEM), chloramphenicol (cat), streptomycin (strA, strB), tetracycline (tetA) and gentamicin (aac(3)-IV) resistance were found. Moreover, genes for hygromycin resistance (hph) and for apramycin resistance were newly determined. In p9134dAT, genes coding for ampicillin, hygromycin, apramycin, gentamicin and tetracycline were lost. The loss of tetracycline resistance in p9134dT was a direct consequence of two recombination events. During the first recombination event, hygromycin, apramycin, gentamicin and tetracycline resistance genes were replaced by rck, srgB, srgA, orf7 and pefI genes originating from Salmonella virulence plasmid pSLT2. During the second recombination event, ydjA, pifA and repC genes from plasmid p9134 were replaced by repA2, pSLT025, pSLT026 genes from pSLT2. These results indicate that the simultaneous presence of plasmid encoded antibiotic resistance and plasmid virulence in Salmonella serovars may lead to their recombination and selection of epidemiologically important plasmids both transferring antibiotic resistance and increasing virulence of their host. In the second part of the thesis I studied plasmids of incompatibility group IncHI1 that play an important role in the dissemination of antibiotic resistance in Salmonella Typhimurium. We determined the complete nucleotide sequences of four IncHI1 plasmids transferring resistance to antibiotics. Moreover, the protein profiles of plasmids were determined by mass spectrometry. The sizes of plasmids were 190 730 bp in pB71, 207 203 bp in p109-9, 210 266 bp in pF8475 and 311 280 in p8025. In addition to 4 sequenced IncHI1 plasmids, we also incorporated 11 IncHI1 plasmids sequences downloaded from GenBank database in order to define the core-genome and pan-genome of IncHI1 plamsids. Phylogenetic analysis of core-genome sequences of 15 examinated IncHI1 plasmids showed that two main lineage of IncHI1 plasmids circulate in population. The GC content of the genes belonging to the core-genome was around 46% and around 50% in accessory genes. Multidrug resistance regions in all four sequenced plasmids extended over 20 kb and, except of tet(B) gene, all genes encoding antibiotic resistance belonged to the genes with the highest GC content. We concluded that IncHI1 plasmids represent replicons that evolved in bacteria with low GC content. During spread from original host to Salmonella, plasmids acquired accesory genes (e.g. antibiotic resistance genes). Genes coding for antibiotic resistance belonged to the most expressed plasmid genes and were significantly expressed even in the absence of antibiotics. Such mechanism likely facilitates the survival of host cells in case of sudden presence of antibiotics in environment.

Keywords

plazmid, antibiotická rezistence, rekombinace, konjugace, IncHI1, Salmonella, komparativní porovnání, proteomika, plasmid, antibiotic resistance, recombination, conjugation, comparative genomics, proteomics

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 9. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 4. 11. 2016
• Supervisor: doc. RNDr. Ivan Rychlík, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Monika Dolejská, Ph.D., doc. RNDr. Roman Pantůček, Ph.D., prof. MUDr. David Šmajs, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Microbiology