<I>In-situ</I> kvantifikace cílových proteinů v bakterii <I>Streptococcus zooepidemicus</I>

Bc. David Číhal

Master's thesis

In-situ quantification of target proteins in Streptococcus zooepidemicus

Abstract:

Cílenou mutagenezí pomocí alelické výměny byly zkonstruovány dva mutantní kmeny Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (SEZ). Do cílového lokusu hasA byla vnesena mutace gfp, která měla zařídit produkci reportérového fluorescentního proteinu v ekvimolárním množství s proteinem zájmu. Ani jeden z mutantů po úspěšné mutagenezi nebyl fluorescentní, a navíc byla narušena produkce kyseliny hyaluronové. Pro otestování metody v SEZ byl zvolen nový reportérový gen kódující β glukuronidasu (gus). Po úspěšné konstrukci mutantního kmene SEZ s deaktivovanou β glukuronidasu nesoucího mutaci gus za genem laktát dehydrogenasa byla stanovena aktivita laktát dehydrogenasy s využitím aktivity reportérového proteinu GUS. Naměřená aktivita GUS byla následně srovnána se změnou koncentrace laktátu v průběhu kultivace mutantního kmene v bioreaktoru. Bylo ověřeno, že SEZ není schopen produkce aktivního GFP. Avšak byla otestována metoda pro kvantifikaci cílového proteinu s využitím gus jako reportérového genu.

Abstract:

Two mutant strains of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (SEZ) were constructed by targeted mutagenesis by allelic exchange. A gfp mutation was introduced into the hasA target locus, which was supposed to arrange the production of the reporter fluorescent protein in an equimolar amount with the protein of interest. None of the mutants were fluorescent after successful mutagenesis, and hyaluronic acid production was also impaired. A new reporter gene encoding β glucuronidase (gus) was chosen to test the method in SEZ. After the successful construction of a SEZ mutant strain with deactivated β glucuronidase carrying a gus mutation behind the lactate dehydrogenase gene, lactate dehydrogenase activity was determined using the activity of the GUS reporter protein. The measured GUS activity was then compared with the change in lactate concentration during the cultivation of the mutant strain in a bioreactor. SEZ was verified to be incapable of producing active GFP. However, a method was tested for target protein quantification using gus as a reporter gene.

Keywords

kyselina hyaluronová, hyaluronát syntasa, Streptococcus zooepidemicus, GFP, alelická výměna, testování aktivity GUS, hyaluronic acid, hyaluronate synthase, allelic exchange, GUS assay

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 5. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 28. 6. 2023
• Supervisor: Ing. Zbyněk Černý
• Reader: Mgr. Stanislav Pepeliaev, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biotechnology / Biotechnology