Měření aktivity enzymů pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-ToF

Bc. Jan STRNAD

Master's thesis

Measuring enzyme activity using MALDI-ToF mass spectrometry

Abstract:

Cu-dependentní aminoxidasy jsou enzymy, jež se účastní mnoha důležitých biologických procesů, mezi něž patří například regulace buněčného růstu, dělení, programované buněčné smrti a odezvy na stresory v prostředí. Přirozenými substráty jsou např. putrescin, kadaverin a spermidin. Aktivita aminoxidas je obvykle měřena spektrofotometrickými, radiometrickými, elektrochemickými či fluorimetrickými metodami. Cílem této práce bylo vytvořit metodu měření aktivity pomocí MALDI ToF hmotnostní spektrometrie na základě signálů substrátu a produktu naměřených se vzorky reakční směsi. Pro tento účel byla použita aminoxidasa purifikovaná ze semenáčků hrachu setého (Pisum sativum). Pomocí metody, jež využívala -kyano-4-hydroxyskořicovou kyselinu s přídavkem cetrimoniumbromidu jako matrici, byly určeny kinetické parametry kcat a Km pro oxidační deaminaci vybraných substrátů, a to na základě závislosti poměrů intenzit signálů produktu a produktu plus substrátu na koncentraci substrátu. Výsledky byly porovnány s paralelním měřením pomocí spektrofotometrické metody využívající spřažené reakce s křenovou peroxidasou a guajakolem a diskutovány s použitím údajů z literatury a databáze BRENDA. Bylo zjištěno, že metoda poskytuje výsledky přesné, jež však nemusejí být správné. Hodnoty Km řádově souhlasily se spodními hranicemi rozsahů uváděných v literatuře, oproti srovnávacímu spektrofotometrickému měření byly nižší. Byl navržen postup zdokonalení metody. Mezi výhody metody patří nízká spotřeba vzorku a náklady na spotřební materiál a to, že na rozdíl od metod používajících MALDI ToF malých molekul bez využití cetrimoniumbromidu nevyžaduje specifický poměr matrice a analytu. Mezi nevýhody patří to, že metoda je založena na relativní kvantifikaci a že může poskytovat horší výsledky při vysokých koncentracích substrátu.

Abstract:

Cu-dependent amine oxidases are enzymes, that are part of many fundamental biological processes, among which belong for example regulalation of cell growth, division, programmed cell death and of reactions to enviromental stressors. Examples of natural substrates are putrescine, cadaverine and spermidine. Activity is usually measured using spectrophotometric, radiometric, electrochemical or fluorimetric methods. The aim of this thesis was to create a method of activity measurement using MALDI ToF mass spectrometry based on signals of substrate and product measured with samples of reaction mixture. For this purpose was used amine oxidase purified from garden pea (Pisum sativum) seedlings. Using a method, that utilizes -cyano-4-hydroxycinnamic acid with added cetrimonium bromide as matrix, kinetic parameters kcat a Km were measured for oxidative deamination of selected substrates, based on the dependence of ratio of intensities of signals of product and of product plus substrate on substrate concentration. Results were compared with parallel measurement using spectrophotometric metod utilizing coupled reaction with horseradish peroxidase and guiacol and discussed with data from literature and BRENDA database. The tested method provides data, that are precise, but may not be accurate. The order of measured Km values was on par with lower ends of ranges found in literature. Values were lower than those measured using spectrophotometric method. Improvement of method was suggested. Advantages of this method include low sample ammount requirements, low cost of consumables and compared to methods using MALDI ToF of small molecules without the use of cetrimonium bromide no specific matrix to analyte ratio requirements. Disadvantages include, that the method is based on relative quantification and may produce skewed results at high substrate concentrations.

Keywords

MALDI ToF, enzymová aktivita, aminoxidasa, Pisum Sativum, měření aktivity

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 4. 2023

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry