Exprese a purifikace proteinu hCASK_SAP

Jakub Drahorád

Diplomová práce

Expression and purification of hCASK_SAP protein

Anotace:

Práce se zabývá expresí a purifikací syntetického fúzního proteinu hCASK_SAP. Protein se skládá z PDZ domény lidského proteinu CASK a saporinu. hCASK_SAP by mohl mít potenciální využití v medicíně. PDZ doména je schopna interakce s proteinem CD98hc, který je ve vysokém množství exprimován některými nádorovými buňkami, čímž by mohl pomoci cílit toxický saporin na tyto buňky. Exprese proteinu probíhala v bakteriích E. coli BL21pLys v obohaceném LB mediu po indukci způsobené IPTG. Lyze i první afinitní purifikační krok byl proveden za denaturačních podmínek navozených 8 M močovinou. Lyze byla způsobena kombinací lysozymu a sonikace za různých podmínek. Purifikace byla založena na afinitě fúzní značky His-tag, která byla na N-terminálním konci proteinu hCASK_SAP, k dvoumocným kationtům kovů. Pro purifikaci byly testovány kationty niklu a kobaltu. Protein byl renaturován odstraněním močoviny pomocí dialýzy. K analýze čistoty byla použita SDS-PAGE a identifikace byla provedena pomocí Western blottingu specifickými protilátkami. hCASK_SAP se podařilo získat přibližně v 50% čistotě s jednou výraznou kontaminantou. Pro vyšší čistotu získaného proteinu je třeba zařadit další purifikační krok, kdy gelová permeační chromatografie naznačuje vhodný směr další purifikace pro získání čistého hCASK_SAP. Hlavním problémem je relativně nízká exprese hCASK_SAP z důvodů toxických vlastností saporinu.

Klíčová slova

hCASK_SAP, exprese, purifikace, saporin, doména PDZ

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 5. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 5. 6. 2024
• Vedoucí: doc. RNDr. Lucie Zemanová, Ph.D.
• Oponent: PharmDr. Hana Navrátilová, Ph.D.

Univerzita Hradec Králové

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Chemie / Toxikologie a analýza škodlivin