Využití fluorescenčních technik k hodnocení buněčného poškození

Mgr. Jan Čapek

Diplomová práce

The use of fluorescence techniques for characterization of cell injury

Anotace:

Fluorescenční buněčné sondy nacházejí v dnešní době své místo především ve výzkumu, i když stále častěji se s nimi můžeme setkat i v klinické praxi. V dnešní době existuje nepřeberné množství takovýchto fluorescenčních sond. Existují sondy pro detekci mitochondriálního potenciálu, nukleových kyselin, produkce ROS atd. Cílem naší práce bylo optimalizovat použití fluorescenčních sond (JC-1, JC-10, Hoechst 33258, CM-H2DCFDA a annexinu V s propidium jodidem), porovnat sondy JC-1, JC-10 a v neposlední řadě použít fluorescenční sondy k charakterizaci modelového buněčného poškození in vitro. V naší práci jsme optimalizovali dobu loadingu sondy JC-1 na hepatomových buňkách HepG2 a buňkách lidského adenokarcinomu A549. Jako optimální jsme určili 30minutovou inkubaci. Tuto dobu loadingu jsme poté použili i u buněk renální linie HK-2. Dále jsme sledovali stabilitu sond JC-1 a JC-10 v čase, kde se ukázalo, že sonda JC-1 je poměrně stabilní oproti sondě JC-10, u níž jsme prokázali vysokou nestabilitu fluorescence. V rámci další práce jsme zavedli stanovení pomocí sond pro detekci nukleových kyselin (Hoechst 33258, propidium jodid), produkce ROS (CM-H2DCFDA) a apoptózy (annexin V) s využitím fluorescenční mikroskopie. Výše uvedené fluorescenční sondy byly použity u buněk renální linie HK-2, které byly ovlivněné acetaminofenem (0, 1 mM). Z fluorescenčních obrázků byla jasně patrná specifita každé z fluorescenčních sond. S použitím sondy Hoechst 33258 bylo zjištěno, že již při inkubaci s 1 ?M acetaminofenem dochází k fragmentaci buněčných jader a fluorescence závislá na této sondě se kumuluje na okraji buňky.

Abstract:

Cellular fluorescent probes have been used especially in the research, even though they are also increasingly occuring in the clinical practices. Presently, a number of various fluorescent probes appear, such as probes for the mitochondrial potential detection, nucleic acids, ROS production etc. The aim of our diploma thesis was 1) to optimize the utilization of these fluorescent probes JC-1, JC-10, Hoechst 33258, CM-H2DCFDA and annexin V with propidium iodide, 2) to compare JC-1, JC-10 probes and, finally, 3) to apply the fluorescent probes in characterization of cellular damage in vitro. In our diploma thesis we have optimized the duration of JC-1 probe loading in human HepG2 and A549 cells. We have determined the 30-minutes incubation as optimal. We used the same loading time also for the HK-2 renal cell line. In addition, we observed the fluorescence stability of JC-1 and JC-10 probes. We found that JC-1 probe was relatively stable compared to JC-10 probe that demonstrated the high instability of fluorescence. Within our next study, we introduced the assessment using probes for the nucleic acids detection (Hoechst 33258, propidium iodide), ROS production (CM-H2DCFDA) and apoptosis (annexin V) with the utilization of fluorescent microscopy. Consequently, all fluorescent probes were used in characterization of acetaminophen toxicity in HK-2 cells. The specificity of fluorescent probe was clearly visible at fluorescence pictures. After acetaminophen incubation, we found the fragmentation of cell nucleus and Hoechst 33258 fluorescence on the cell edge of the cell. Our results showed that the use of intracellular fluorescent probes in well for the characterization of cell damage in vitro.

Klíčová slova

fluorescenční sondy, apoptóza, buněčné poškození, acetaminofen

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 5. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 3. 6. 2015
• Vedoucí: doc. RNDr. Tomáš Roušar, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Bioanalytik