Sekvenční variabilita genu mtCOII jako nástroj pro studium efektu zakladatele u populací mandelinky bramborové v České republice

Bc. Barbora Codlová

Master's thesis

Sequential variability of gene mtCOII as a tool for study of founder effect in potato beetle populations in the Czech Republic

Abstract:

Mandelinka bramborová (Leptinotarsa decemlineata Say, 1824) je nejvýznamnějším celosvětově rozšířeným škůdcem brambor (Solanum tuberosum L.). Podle publikovaných výsledků se v evropských populacích vyskytuje pouze jediný haplotyp genu mtCOII. To odpovídá hypotéze, že se mandelinka na evropský kontinent rozšířila díky jediné úspěšné invazi. Evropské populace tudíž vznikly z velmi nízkého počtu jedinců. Je tak možné hovořit o efektu zakladatele. Tato diplomová práce se v první části zabývá výzkumem sekvenčních polymorfismů části mitochondriálního genomu nesoucího geny nad2, trnW, trnC, trnY, mtCOI, trnL, mtCOII, trnK, trnD a atp8. Pro analýzy bylo použito celkem 34 jedinců z různých lokalit České a Slovenské republiky. Na základě publikovaných genomů brouků čeledi Chrysomelidae byly navrženy degenerované primerové páry pro primární sekvenaci studované oblasti mtDNA mandelinky. Následně bylo navrženo 5 druhově specifických sekvenačních primerových párů, které umožnily získání konsensus sekvence o velikosti 3395 bp. Bylo zjištěno, že v rámci hodnocených jedinců byl nalezen pouze jediný haplotyp. Tento výsledek byl v souladu s publikovanými informacemi o neexistující variabilitě vybraných oblastí mtDNA u evropské populece mandelinky.Sekvenční data studované oblasti mtDNA byla použita pro zpracování in silico fylogenetické studie, která zahrnovala vybrané zástupce čeledí Chrysomelidae, Bruchidae, Cerambycidae a Tenebrionidae. Haplotypy byly určeny pomocí programu DnaSP 6. Program MEGA X byl použit pro fylogenetickou analýzy založenou na metodě maximální věrohodnosti (ML). Pro konstrukci stromu byl použit model GTR+G+I. Fylogenetická analýza odhalila momofyletický původ čeledi Chrysomelidae. Taxonomická jednotka tribus je zřejmě jednotkou umělou, protože molekulární analýza klastruje některé zástupce rodů Gastrolina a Galeruca odlišným způsobem. Analýza prokázala, že rody Leptinotarsa a Chrysolina jsou seterské.Pro populační analýzy hodnotící genom larev mandelinky je důležité mít informace o jejich pohlaví. Vzhledem k tomu, že u larev neexistuje zřejmý pohlavní dimorfismus, byly při řešení diplomové práce vyvinuty dva markerovací systémy založené na relativní kvantifikaci lokusů lokalizovaných na gonozomech a autozomech. Pomocí parametru Ratio Δ Ct bylo stanoveno relativní množství templátové DNA u lokusu Ldvssc1, lokalizovaného na gonozomu X ve dvou kopiích u samic a v jedné kopii u samců. Dva navržené markerovacé systémy prokázaly, že hodnoty Ratio Δ Ct jsou u samic dvojnásobné oproti hodnotám samců. Pomocí diskriminační a kanonické analýzy byla statisticka potvrzena schopnost obou markerovacích systémů rozlišit jedince samičíhoa samčího pohlaví. Neparametrickým χ2 testem bylo potvrzeno, že poměr samičího a samčího pohlaví odpovídal u vybraného vzorku populace poměru 1:1.Řešení diplomové práce bylo podpořeno projekty GA FAPPZ Studium geneticky podmíněných vlastností s využitím molekulárně – genetických, bioinformatických a statistických metod (SV20-9-21360), Molekulární analýza nukleových kyselin rostlin a živočichů a možnosti jejího hodnocení s využitím metod bioinformatiky a biostatistiky (SV19-07-21360) a projektu NAZV MZe ČR Inovace integrované ochrany brambor proti mandelince bramborové založené na nových poznatcích genetických a biologických charakteristik (QK1910270).

Abstract:

The Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say, 1824) is a worldwide spread pest of the potato plant (Solanum tuberosum L.). According to the published results, only one haplotype of mtCOII gene occurs in European populations. This is in accordance with the hypothesis that suggests a single successful invasion which allowed the Colorado potato beetle to spread to the European continent. Therefore, European populations have origin in a very small number of individuals which is described as the founder effect.In its fisrt part, this diploma thesis focuses on the research of sequence polymorphism of a part of the mitochondrial genome where are located following genes: nad2, trnW, trnC, trnY, mtCOI, trnL, mtCOII, trnK, trnD and atp8. It has been used a total of 34 individuals from various locations of the Czech and Slovak Republic for the analysis. Based on the published genomes of the beetles from the Chrysomelidae family, degenerate primer pairs were designed for primary sequencing of the studied mtDNA region of the Colorado potato beetle. Subsequently, 5 species-specific primer pairs were designed, which allowed to obtain a consensus sequence of 3395 bp. It was found that there is only one haplotype within the evaluated individuals. This result was consistent with published information on the non-existent variability of selected mtDNA regions in the European Colorado potato beetle populations.Sequence data of the studied mtDNA region were used to process an in silico phylogenetic study, which included selected members from the families Chrysomelidae, Bruchidae, Cerambycidae and Tenebrionidae. Haplotypes were determined using the DnaSP 6 program. The MEGA X program based on the maximum likelihood (ML) methos was used for phylogenetics analysis. The GTR+ G+I model was used for phylogenetic tree construction. Phylogenetic analysis revealed the monophyletic origin of the Chrysomelidae family. The taxonomic unit tribus is probably an artificially created unit, because molecular analysis clusters some members of the Gastrolina and Galeruca genus differently. The analysis showed that the Leptinotarsa and Chrysolina genera are sisterly. It is important to have information about the gender of larvae of the Colorado potato beetle for the population analysis. Due to the fact that there is no obvious sexual dimorphism in larvae, two marker systems based on the relative quantification of loci located on gonosomes and autosomes were developed. Using the Ratio Δ Ct parameter, the relative amount of the template DNA at the Ldvssc1 locus, located on the X gonosome, was determined in two copies in females and one copy in males. The two proposed marker systems showed that the Ratio Δ Ct values in females are twice as high as in males. The discriminant and canocinal analysis statistically confirmed the ability of both marker systems to distinguish between females and males individuals. Non-parametric χ2 test confirmed that the ration of female to male sex corresponded to a 1:1 ratio in a selected sample of the population.The solution of the diploma thesis was supported by projects GA FAPPZ Study of genetics conditions using molecular genetic, bioinformatics and statistical methods (SV20-9-21360), Molecular analysis of nucleic acids of plants and animals and the possibility of its evaluation using methods of bioinformatics and biostatistics (SV19-07-21360) and project NAZV MZe Innovation of integrated protection of potatoes against potato beetle based on new knowledge of genetic and biological characteristics (QK1910270).

Keywords

mandelinka bramborová, Leptinotarsa decemlineata, gen mtCOII, efekt zakladatele, populace

Keywords

Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata, gene mtCOII, founder effect, population

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl
• Reader: Jaroslav Salava, CSc., externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology