Imunostanovení s fluorescenčními nanočásticemi pro detekci Melissococcus plutonius

Mgr. Miroslav Herczeg

Bachelor's thesis

Immunoassay with fluorescent nanoparticles for detection of Melissococcus plutonius

Abstract:

In this thesis, applications of upconversion nanoparticles as fast and sensitive approach for the detection of Melissococcus plutonius were studied. M. plutonius is the causative agent of European foulbrood in bees. To better understand the principle of immunoassays, the simple enzyme-linked assays (ELISA) were performed. Upconversion nanoparticles NaYF4:Yb3+,Er3+ were activated with the help of click-chemistry based on azide and BSA-alkyne interaction. The nanoparticles were characterized by gel electrophoresis based on fluorophores incorporated during conjugation. Afterwards, we proceeded to design an upconversion-linked immunoassay (ULISA), which should offer increased sensitivity compared to conventional assays. We have tested direct and indirect variants followed by comparison with a commonly used fluorophore – fluorescein and conventional ELISA. The limit of detection for FIA and ELISA was around 10^4 CFU·ml-1, while with ULISA, LOD of 1466 CFU·ml-1 was obtained.

Abstract:

V této práci byly studovány možnosti využití upkonverzních nanočástic při rychlé a citlivé variantě detekce patogenu Melissococcus plutonius, který způsobuje hnilobu včelího plodu u včely medonosné. Pro lepší pochopení principu imunostanovení bylo nejdříve vyzkoušeno a optimalizováno jednoduché enzymatické imunostanovení (ELISA). Upkonverzní nanočástice NaYF4:Yb3+,Er3+ byly aktivovány za pomoci click-chemie azidu a BSA-alkynu. Dále byly charakterizovány gelovou elektroforézou na základě fluoroforů, které do nich byly při konjugaci inkorporovány. Následně bylo navrženo a provedeno upkonverzní imunostanovení (ULISA). Byla testována jak přímá, tak nepřímá varianta těchto stanovení. Nakonec proběhlo porovnání s klasickým fluoroforem – fluorosceinem a konvenčním ELISA stanovením. Limity detekce u FIA a ELISA stanovení se pohybovaly kolem 10^4 CFU·ml-1, přičemž limit dosažený u ULISA stanovení byl 1466 CFU·ml-1.

Keywords

Immunoassay, Photon-upconverting nanoparticles, ELISA, ULISA, FIA, Fluorescence, European Foulbrood, Melissococcus plutonius, Imunostanovení, Upkonverzné nanočástice, Hniloba včelího plodu

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 25. 6. 2019
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.
• Reader: Mgr. Radka Obořilová

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry