Molekulárně genetická diferenciace lékařsky významných kvasinek rodu Pichia

Michaela Tyčová

Diplomová práce

Molecular genetic differentiation of medically important yeasts from the genus Pichia

Anotace:

Cílem této práce bylo nalezení spolehlivého způsobu vzájemného rozlišení kvasinek druhů Candida fabianii, Candida pelliculosa a Candida utilis. Za tímto účelem byla testována genetická metoda Melting curve of Random Amplified Polymorphic DNA (McRAPD), založená na rozdílech v teplotě tání produktů amplifikace variabilních oblastí genomu. Studovaný soubor tvořilo celkem 61 kultur, z toho 47 představovaly klinické izoláty a 14 pocházelo z různých sbírek, včetně typových kmenů všech tří druhů. Izolace DNA byla provedena modifikací tzv. párátkové techniky, popsané a optimalizované Steffanem et al. (1997). DNA byla amplifikována v RoboCycleru Gradient 96 (Stratagene) s využitím empiricky optimalizovaného protokolu. Jako porovnávací fenotypová metoda byla použita komerční biochemická souprava ID 32 C (bioMérieux) vyhodnocovaná programem Apiweb (bioMérieux) a doplněná o testy fermentace pěti sacharidů. Ve studovaném souboru bylo pomocí McRAPD identifikováno 51 kultur C. fabianii, po pěti pak bylo zařazeno do druhů C. pelliculosa, resp. C. utilis. U sbírkových kmenů se genetická identifikace vždy shodovala s jejich původním určením. Naopak rozpor s primárními výsledky fenotypové diferenciace byl zjištěn u naprosté většiny klinických izolátů. Celkem 46 z nich bylo geneticky klasifikováno jako C. fabianii, přičemž 37 kultur bylo původně biochemicky určeno jako C. pelliculosa a devět jako C. utilis. McRAPD přitom prokázala potenciál pro konfirmaci výsledků fenotypových metod, neboť vizuální analýza křivek tání umožňovala většinou jednoznačnou druhovou identifikaci izolátů. Příčinou neshod mezi výsledky genetické klasifikace a biochemické identifikace u studovaného souboru klinických izolátů je absence C. fabianii v databázi programu Apiweb. C. pelliculosa a C. utilis však do ní zařazeny jsou, proto je možné tyto druhy uvedeným postupem s velkou pravděpodobností správně určit. Naopak spolehlivý nástroj identifikace C. fabianii představují v současné době pouze genetické metody, které jsou navíc rychlejší a přesnější. Z výsledků této práce dále vyplývá, že McRAPD je velmi vhodnou metodou pro exaktní diferenciaci C. fabianii, C. pelliculosa a C. utilis. Současně bylo zjištěno, že se C. fabianii pravděpodobně vyskytuje v klinickém materiálu s výrazně vyšší frekvencí než zbylé dva druhy. Proto je nanejvýš žádoucí ji co nejdříve zařadit do databází komerčních biochemických identifikačních souprav

Abstract:

The aim of this study was to find a reliable way of differentiation between the yeast species Candida fabianii, Candida pelliculosa and Candida utilis. For this purpose, a genetic method called melting curve of random amplified polymorphic DNA (McRAPD) was tested, which is based on differences in melting temperatures of amplification products of variable areas of the genome. The studied group consisted of 61 cultures, of which 47 represented clinical isolates and 14 were from various collections, including type strains of all three species. DNA extraction was performed by modifying the so-called toothpick technique described and optimized by Steffan et al. (1997). DNA was amplified in RoboCycler Gradient 96 (Stratagene) using an empirically optimized protocol. As a comparative phenotypic method, the ID 32 C commercial biochemical kit (bioMérieux) was used, assessed by the Apiweb software (bioMérieux) and supplemented by five carbohydrate fermentation tests. Using McRAPD, 51 cultures were identified as C. fabianii, the remaining 10 were classified as C. pelliculosa (n=5) and C. utilis (n=5). In the collection strains, genetic identification always coincided with their original determination. Conversely, the vast majority of clinical isolates were found to be different from the primary results of phenotypic differentiation. A total of 46 of them were genetically classified as C. fabianii, with 37 cultures being biochemically identified as C. pelliculosa and 9 as C. utilis. McRAPD has demonstrated a potential to confirm the results of phenotypic methods since the visual analysis of melting curves allowed accurate species identification of the majority of isolates. The disagreement between the results of genetic and biochemical identification in the studied group of clinical isolates originated from the absence of C. fabianii in the Apiweb software database. However, this contains both C. pelliculosa and C. utilis. Therefore, it was possible to identify these species correctly using the procedure. Conversely, genetic methods are currently the only reliable tool for identification of C. fabianii isolates. Moreover, they are faster and more accurate. Further, the results of our study show that McRAPD is a very suitable method for accurate differentiation between C. fabianii, C. pelliculosa and C. utilis. It was also found that C. fabianii is likely to be significantly more prevalent in clinical material than the other two species studied. Therefore, it is highly desirable to incorporate this species into databases of commercial biochemical identification systems as soon as possible

Klíčová slova

Kvasinky, rod Pichia, identifikace, genetické metody, melting curve of random amplified polymorphic DNA

Keywords

Yeasts, genus Pichia, identification, genetic methods, melting curve of random amplified polymorphic DNA

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 6. 2010
• Vedoucí: Petr Hamal
• Oponent: Vladislav Raclavský

Univerzita Palackého

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie