Studium přirozeného vývoje Lidského Cytomegaloviru a jejich vztah k variabilitě hlavních antigenů

MUDr. Zdeněk NOVÁK

Doctoral thesis

Study of natural history of Human Cytomegalovirus and its relationship to variability of major antigens

Abstract:

Lidský cytomegalovirus (CMV) je jeden z nejvíce rozšířených virů infikujících většinu lidí během jejich života. Je to ?-herpesvirus definovaný dlouhým životním cyklem a druhově omezenou hostitelskou specificitou. Virus způsobuje oportunní infekci u zdravých jedinců. U imunokompromitovaných jedinců, jako jsou pacienti po transplantaci nebo HIV infikovaní jedinci, kteří nejsou schopni vytvořit adekvátní buněčnou odpověď, může způsobit akutní onemocnění. U těhotných žen je běžnou příčinou kongenitální infekce plodu potenciálně způsobující sensorineurální ztrátu sluchu a poškození mozku. CMV je obyčejně přenášen přímým kontaktem s infikovanými tělesnými exkrety, krevní transfuzí nebo skrze transplantovaný orgán či kostní dřeň. Celková séroprevalence v rozvinutých zemích je 30-70%. Cílem práce je ozřejmění otázek spojených s klinickými a laboratorními aspekty cytomegalovirové infekce. Práce byla tematicky rozdělena do tří vzájemně propojených skupin: Kmenová variabilita. U mnoha CMV genů byla prokázána významná variabilita dovolující odlišit jednotlivé klinické izoláty (kmeny). Kmenová variabilita potenciálně způsobuje problémy při CMV detekci. Například vývoj skríningové techniky založené na PCR byl spojen zpočátku se sníženou citlivostí metody následovanou falešně negativními výsledky v důsledku výrazné genové variability. Srovnání různých metod použitých k detekci CMV genotypů v genech kódujících glykoproteiny B a N umožnilo vyhodnotit jejich účinnost ve vyhledávání CMV genotypů a potvrdit jednoznačně infekci způsobenou několika různými CMV kmeny u seropozitivních imunokompetentních žen. Stejný přístup byl použit u kongenitálně infikovaných novorozenců s cílem zjistit, zda mnohočetná CMV infekce je schopná způsobit infekci plodu. Výsledky ukazují, že mnohočetná infekce matek může být přenesena přes placentární barieru na plod. I v tomto případě byly potvrzeny známky kmenové kompartmentalizace. Uvedená fakta mohou ovlivnit vývoj efektivní vakcíny proti CMV, neboť většina vakcín je založena na dříve předpokládaných konzervativních částech proteinů. CMV reinfekce Přirozeně vzniklá imunitní odpověď není schopná zamezit infekci novými CMV kmeny u dříve CMV séropozitivních individuí. Bylo však již dříve demonstrováno, že přirozená imunita je schopná snížit frekvenci intrauterinní infekce přibližně o 30%. V rámci části své dizertační práce jsem se proto zaměřil na vývoj rekombinantních, kmenově specifických antigenů a vývoj ELISA metody schopné detekovat reinfekci v sériových vzorcích. Reinfekce je v de definována jako vznik nových, kmenově specifických protilátek v sekvenčních vzorcích. Metoda byla následovně použita k detekci reinfekce u zdravých séropozitivních žen. Reinfekce byla zjištěna u 29% žen. Analýza obecně uznávaných rizikových faktorů pro CMV infekci nepotvrdila žádnou spojitost. Bylo také ukázáno, že přítomnost protilátek proti nejméně jednomu testovanému antigenu snížilo riziko reinfekce o 63% což nasvědčuje protektivní roli protilátek. V další studii zaměřené na matky s prenatálně infikovanými kojenci jsme demonstrovali, že frekvence reinfekce byla signifikantně vyšší u matek infikovaných dětí ve srovnání s matkami neinfikovaných dětí (17.5% vs 4.6%). Pomocí genotypizace bylo následovně ukázáno, že většinový zdroj infekce plodu byla reinfekce matek. Detekce CMV. Korektní detekce viru a přesná kvantifikace je velmi důležitá. Naším hlavním cílem bylo vytvořit a otestovat CMV detekční metodu potencialně použitelnou ke skríningu. Různými detekčními metodami jsme testovali vzorky získané od přibližně 35000 novorozenců. Výsledky byly porovnány se současnou referenční

Abstract:

metodou. Byla vyvinuta nová detekční metoda založená na multiplexové real-time PCR testující vzorky slin s citlivostí 100% a specificitou 99,9% a vzorky zaschlých slin s citlivostí 97,4% a specificitou 99,9%. Vyvinutá technika byla použita u sériových vzorků získaných od CMV séropozitivních žen k zjištění hodnot virurie a DNAemie. Výsledky testů ukazují,

Abstract:

Human cytomegalovirus (CMV) is one of the most commonly widespread viruses infecting a majority of humans at some time in their lives. It is a ?-herpesvirus defined by a long life cycle and restricted hosts. The virus has been shown to be a cause of opportunistic disease in normal hosts. In immunocompromised hosts such as transplant patients or HIV-infected subjects, who are unable to build proper cellular response, it can produce acute disease. In pregnant women it is the most common congenital viral infection carried by transplacental transmission to the fetus, potentially causing sensorineural hearing loss and brain damage as the most serious sequelae. CMV is usually transmitted via direct contact with infected bodily excretions, via blood transfusions, or through organ or bone marrow transplantation. The overall seroprevalence is 30-70% in developed countries. The aim of this paper is to elucidate questions related to clinical and laboratory aspects of cytomegaloviral infection. The themes were divided into three related subjects: Strain variation. Many CMV genes have been shown to be significantly variable allowing us to distinguish clinical isolates/strains. The strain variability potentially affects tasks related to CMV infection such as development of PCR-based screening technique, where previously unknown variability lowered the sensitivity of the screening assay resulting in false-negative results. Various techniques have been used to detect different genotypes of CMV within the gN and gB genes. This allowed us to compare efficiency of different techniques in finding different genotypes of CMV and show infection caused by multiple strains of CMV virus in seropositive immunocompetent women. The same approach was applied to congenitally infected newborns to determine whether multiple CMV viruses can prenatally infect the fetus. The results suggest that multiple strains are capable of crossing the placenta and causing infection. Also, signs of CMV strain compartmentalization were found. These facts might also collide with development of an efficient CMV vaccine since most of the tested vaccines were based on supposedly conserved regions of proteins. CMV reinfection Naturally developed immune responses are not capable of preventing infection by new CMV strains in previously CMV seropositive individuals, even though it has been shown that natural immunity is capable of lowering rates of intrauterine transmission by approximately 30%. Here we focused on development of recombinant strain-specific antigens and an ELISA-based assay capable of detecting reinfection in serial samples. Reinfection is recognized by the appearance of new strain-specific antibodies in sequential samples. This assay was consequently used to detect reinfection in healthy seroimmune women. Reinfection was detected in 29% of women and analysis of commonly recognized risk factors for CMV infection was unable to identify any linkage. It was also shown that presence of antibodies against at least one of the tested antigens at baseline decreased risk of reinfection by 63%, suggesting a protective role of antibodies. In other study on group of mothers of congenitally infected infants results show that reinfection occurs with a statistically significant higher frequency in mothers of infected infants compared to mothers of uninfected babies (17.5% vs 4.6% respectively) and, consequently, it was shown by CMV genotyping that the major source of congenital infection is reinfection of mothers CMV detection Correct and accurate viral detection as well as its correct quantification is very important. Our main focus was to develop and test a CMV detection technique with the possibility of its being considered as a screening tool. We tested samples collected from approximately 35,000 newborns using various techniques and compared them to the current "gold standard" technique. We developed a multiplexed real-time PCR-based detection assay utilizing liquid

Keywords

cytomegalovirus, kmenová diversita, detekce, multiplexované PCR, reinfekce, glykoprotein B, glykoprotein N

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 4. 2012

Accessible from:: 11. 4. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 6. 6. 2012

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Immunology / Medical Immunology