Vliv parametrů ekvilibrace a mrazení ejakulátu býků na motilitu spermií po rozmrazení

Monika Beránková

Diplomová práce

Effect of equilibration and freezing parameters on bull sperm motility after thawing

Anotace:

Hypotézou práce je předpoklad průkazných rozdílů v životaschopnosti spermií charakterizované vyšší motilitou a podílem živých spermií po rozmrazení inseminačních dávek vyrobených při aplikaci prodloužené ekvilibrace a nižšího teplotního gradientu mrazení. Cílem práce bylo zjistit, zda mají odlišné podmínky ekvilibrace a mrazení vliv na životaschopnost spermií po rozmrazení. V teoretické části práce jsou shrnuty informace o parametrech ejakulátu býků, metodách jeho hodnocení a především o jeho zpracování a dlouhodobé konzervaci. V průběhu let 2013-2015 byl na inseminační stanici odebírán ejakulát od předem vybrané skupiny plemenných býků, skupina čítala 5 býků s ohledem na stejný věk, plemeno a podmínky ustájení a ošetřování. Odebraný ejakulát byl po vstupním hodnocení rozdělen na několik částí, které byly zpracovány různým způsobem. Část inseminačních dávek byla standardně ekvilibrována po dobu 120 minut, následně byla polovina pejet standardně mrazena metodou Direct Freezing dle standardní 3-fázové mrazicí křivky a polovina pejet dle odlišné 2-fázové mrazicí křivky. Druhá část inseminačních dávek byla ekvilibrována po dobu 240 minut a mrazena jako v předchozím případě dle 3-fázové standardní mrazicí křivky a dle 2-fázové mrazicí křivky. Zmrazené inseminační dávky byly poté uloženy v kontejneru s tekutým dusíkem při -196°C. Byla hodnocena motilita spermií pomocí CASA, dále podíl živých a mrtvých spermií pomocí barvení Eosinem a Nigrosinem a reakce membrán spermií pomocí HOS testu, který zjišťuje reakci membrán bičíků spermií na vytvořené hypoosmotické prostředí. Výsledky dokumentují vyšší progresivní motilitu spermií a podíl živých spermií na základě barvení (+5,57 %; +4,47 %) při použití prodloužené délky ekvilibrace (240 min) rozdíly oproti použití standardní délky ekvilibrace (P < 0,01). Souhlasně byly nalezeny i vyšší hodnoty celkové motility a HOS testu při použití prodloužené délky ekvilibrace, avšak rozdíly nebyly statisticky průkazné. Při mrazení na základě odlišných mrazicích křivek byly zjištěny vyšší hodnoty (v průměru +1,6 %) téměř u všech sledovaných parametrů spermií po rozmrazení při použití 3-fázové mrazicí křivky, nalezené rozdíly nebyly statisticky průkazné. Při hodnocení parametrů ejakulátu u býků zde byly mezi býky nalezeny statisticky významné rozdíly (P < 0,01) v celkové a progresivní motilitě, podílu živých spermií a HOS testu, je tudíž patrná individualita mezi býky v odpovědi na metodiku zpracování ejakulátu. Při hodnocení charakteristik pohybu spermií z CASA zde byly nalezeny statisticky významné rozdíly mezi býky u VCL, VSL, VAP, LIN, STR, WOB, taktéž mezi různými délkami ekvilibrace (P < 0,01), avšak rozdíly nebyly nalezeny u těchto parametrů pohybu spermií při použití různých mrazicích křivek.

Abstract:

The hypothesis assume the existence differences in bulls spermatozoa viability after thawing, characterized by higher values of motility and higher proportion of live spermatozoa, in case of prolonged equilibration and lower temperature freezing gradient. The aim of this thesis was to find the influence of different equilibration and freezing curve conditions to on spermatozoa viability after thawing. The theoretical part of the thesis summarizes available information about the bulls semen parameters, methods for its evaluation and especially the processing and long-term preservation. Within the case study part of the thesis, during the years 2013-2015 the semen of the pre-selected group of 5 breeding bulls was being collected at the Sires insemination center. The group was uniform as to age, breed and housing and treatment conditions. After initial assessment the collected semen was divided into parts, which were then processed in different wals. A part of straws was processed by standard protocol, the other part was processed using different length of equilibration and freezing curve. First part of the straws was equilibrated in a standard protocol for 120 minutes; subsequently half of the equilibrated straws was standardly frozen by the Direct Freezing method based on 3-phase freezing curve while the other half was frozen using the different 2-phase freezing curve. Second part of the straws was initially equilibrated for 240 minutes with the subsequent freezing, similarly as in the previous case, used 3-phase and 2-phase freezing curve. Frozen straws were then stored in liquid nitrogen container at -196 °C. Spermatozoa motility was evaluated using CASA. The semen was further evaluated on the proportion of live and dead spermatozoa, using coloration of Eosin and Nigrosine, and on the sensitivity of the spermatozoa membranes, using HOS test, which detects the reaction of spermatozoa tail membrane to hypoosmotic conditions. The obtained results indicated higher progressive spermatozoa motility (+5.57 %) and higher percentage of live spermatozoa (+4.47 %) following the application of the prolonged equilibration (240 min). When applying the length of equilibration 240 minutes, the values of total spermatozoa motility and HOS test were higher as well, though the differences were not statistically significant. When evaluate the effect of using different freezing curves on the parameters of the spermatozoa after thawing, higher values (average + 1.6 %) at almost all of these parameters using 3-phase freezing curve were found, the diferrences were not statistically significant. Statistically significant differences among the bulls (P < 0.01) were found in total as well as progressive spermatozoa motility, in the proportion of living spermatozoa and in value of the HOS test - the individuality among the bulls is therefore evident. While evaluating the characteristics of spermatozoa movement by CASA, statistically significant differences among the bulls were confirmed at VCL, VSL, VAP, LIN, STR, WOB (P < 0.01), also between the diferrent length of equilibration (P < 0.01), but were not statistically significant when using diferrent freezing curves.

Klíčová slova

ejakulát, inseminační dávka, oplozovací schopnost, býk

Keywords

a bull, a semen, an insemination dose, a fertilization ability

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 4. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Ing. Luděk Stádník, Ph.D.
• Oponent: Zuzana Biniová, externi

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Rozvoj venkova a zemědělství / Zemědělství