Identifikace glykoproteinů v kultivarech hrachu setého

Bc. Eliška VEVERKOVÁ

Master's thesis

Identification of glycoproteins in cultivars of Pisum sativum

Abstract:

Glykosylace proteinů patří mezi časté posttranslační modifikace. Mezi nejběžnější typy patří N- a O-glykosylace. Glykoproteiny se v rostlinách vyskytují hlavně v N-vázané formě. Mezi ně patří zásobní proteiny rostlin, germiny a proteiny podobné germinům. Glykoproteiny zastávají v rostlinách mnoho funkcí. Jedná se o procesy skládání a transport proteinů, buněčnou signalizaci a růst, životnost buněk a zprostředkování interakce s patogeny a receptory. Cílem této práce bylo identifikovat glykoproteiny v extraktech kultivarů hrachu setého (Pisum sativum) konkrétně se jednalo o kultivary Oskar, Slovan, Frisson, Arvika, Moravan, Menhir a Pisum sativum subsp. elatius. Pro analýzu byly dodány extrakty několikadenních naklíčených semen těchto kultivarů od firmy Agritec s.r.o., Šumperk. Specifické detekce glykoproteinů bylo dosaženo barvením gelů po elektroforéze pomocí alcianové modři. Pro izolaci glykoproteinů a glykopeptidů byly použity metody založené na afinitní chromatografii. Glykoproteiny byly izolované pomocí metody s hydrazid-biotinem a následným zachycením na kaptavidin Agarose. U glykopeptidů byl jako chromatografický sorbent využit konkanavalin A Sepharosa. Izolované proteiny byly podrobeny enzymovému štěpení a vzniklé peptidy byly identifikovány po separaci kapalinovou chromatografií pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie MALDI TOF-TOF. Identifikováno bylo mnoho proteinů, z nichž proteiny obsahující ve své aminokyselinové sekvenci glykosylační místa patřily mezi zásobní proteiny, proteiny rodiny germinů a 14-3-3 proteiny. U 14-3-3 proteinů se podařilo potvrdit, že se jedná o glykoproteiny.

Abstract:

Protein glycosylation is a frequent post-translational modification. The most common types include N- and O-glycosylation. In plants, glycoproteins are presented mainly in N-linked form. Among them are seed storage proteins, germins and germin-like proteins. Glycoproteins have many functions in plants. These are processes of protein folding and transport, cell signaling and growth, cell life and interactions with pathogens and receptors. The aim of this work was to identify glycoproteins in pea (Pisum sativum) cultivar extracts, namely cultivars Oskar, Slovan, Frisson, Arvika, Moravan, Menhir and Pisum sativum subsp. elatius. For the analysis, were supplied extracts of several days germinated seeds of these cultivars from Agritec s.r.o., Šumperk. Specific glycoprotein detection was achieved by staining the gels after electrophoresis using alcian blue. For isolation of glycoproteins and glycopeptides were used methods based on affinity chromatography. Glycoproteins were isolated using the hydrazide-biotin method and subsesquent captured on the captavidin agarose. For glycopeptides, concanavalin A sepharose was used as the chromatographic sorbent. Isolated proteins were subjected to enzymatic cleavage and the generated peptides were identified after separation by liquid chromatography using MALDI TOF-TOF tandem mass spectrometry. Many proteins were identified, the proteins which contained glycosylation sites in their amino acid sequences belonged to storage proteins, germin family and 14-3-3 proteins. 14-3-3 proteins have been shown to be glycoproteins based on method with hydrazide biotin.

Keywords

glykoproteiny, N-glykosylace, germiny, afinitní chromatografie, hmotnostní spektrometrie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry