Imunitní systém prasat a jeho odpověď na infekci Mycobacterium avium

Mgr. Hana Štěpánová, Ph.D.

Disertační práce

Immune system of pig and its response to Mycobacterium avium infection

Anotace:

Předkládaná disertační práce je zaměřená na imunologické aspekty mykobakteriálních infekcí u prasat s důrazem na poznatky využitelné pro rozvoj intravitálních diagnostických metod. Pro charakteristiku imunitní odpovědi prasat na infekci M. avium byla, mino jiné, využitá metoda průtokové cytometrie, která je částečně představená v úvodní části práce. Důležitou součástí imunitní odpovědi na mykobakteriální infekce je buňkami zprostředkovaná imunita. Pro její detekci byly využity dvě metody: test blastické transformace založený na proliferační aktivitě lymfocytů a interferonový test, jehož principem je detekce IFN-γ produkovaného buňkami po stimulaci specifickým antigenem. Obě metody prokázaly specifickou buňkami-zprostředkovanou imunitní odpověď v krvi, slezině i mezenteriálních mízních uzlinách prasat infikovaných M. avium subspecies avium (MAA). Analýza byla provedena 6 měsíců po experimentální infekci. Pomocí průtokové cytometrie bylo prokázáno, že hlavní populací lymfocytů, která je zdrojem IFN-γ po stimulaci specifickým antigenem jsou dvojitě pozitivní CD4+CD8+ buňky. Dále byly testovány dvě potenciální intravitální diagnostické metody. Interferonový test pro detekci buňkami-zprostředkované imunity byl porovnán s detekcí specifických protilátek pomocí ELISA u prasat infikovaných dvěma poddruhy MAA a M. avium subspecies hominissuis (MAH) v době před infekcí a 14 a 24 týdnů po experimentální infekci. U prasat infikovaných MAA byla detekovatelná jak buňkami-zprostředkovaná imunita, tak specifické protilátky v séru v obou termínech. Po infekci MAH byl průběh imunitní odpovědi odlišný. Buňkami-zprostředkovaná imunita byla detekována pouze u dvou z deseti infikovaných zvířat 14. týden a u poloviny zvířat 24. týden po infekci. Specifické protilátky v krevním séru experimentálních prasat byly pod detekčním limitem po celou dobu trvání experimentu. V následujícím in vitro experimentu byly prasečí makrofágy infikovány stejnými kmeny MAA a MAH. Výsledky prokázaly nižší schopnost MAH kmene stimulovat makrofágy k produkci pro- i protizánětlivých cytokinů. Na základě dat z obou experimentů můžeme shrnout, že MAH má nižší imunogenní kapacitu než MAA kmen. Jak naznačují výsledky předchozích experimentů, interferonový test je použitelná metoda pro diagnostiku M. avium infekce u prasat. Tento fakt byl potvrzen i v terénní studii, kde interferonový test vykazoval vyšší citlivost ve srovnání s kožním tuberkulinovým testem, který přestavuje v současnosti běžně používaný intravitální test. Na základě dat obsažených v disertační práci, lze shrnout, že hodnocení buňkami-zprostředkované imunity pomocí interferonového testu je účinným nástrojem pro intravitální diagnostiku mykobakteriálních infekcí u prasat. Interferonový test vychází jako citlivější metoda v porovnání s tuberkulinovým testem i s detekcí specifických protilátek. Nicméně je nutné uvést, že použitelnost interferonového testu je omezená v případech, kdy dochází ke slabé indukci specifické imunitní odpovědi, například v důsledku nízké imunogenicity mykobakteriálního kmene.

Abstract:

The thesis is focused on the immunological aspect of mycobacterial infection in pigs with an ambition to make a steady foundation for the development of intravital diagnostic methods. Flow cytometry was one of the methods used for characterization of the immune response of pigs to the infection and just this method is partially included in the thesis. Cell mediated immunity is an important component of host immune defense against mycobacteria. Two methods were used for the evaluation of the specific cell-mediated immunity in M. avium subspecies avium (MAA): a proliferation assay and an IFN-γ release assay which is based on in vito restimulation of specific lymphocytes and subsequent measurement of IFN-γ by ELISA. Cell-mediated specific immunity was detectable in blood and even in the spleen and mesenteric lymph nodes at least 6 months after MAA infection. Based on the flow cytometry analyses, CD4+CD8+ double positive lymphocytes which represent relatively frequent porcine lymphocyte subset were the main source of IFN-γ after the specific restimulation with MAA antigen. Subsequently, two possible intravital diagnostic methods were tested. Specific antibodies detected by ELISA and cell-mediated immunity evaluated by IFN-γ release assay were monitored in MAA and M. avium subspecies avium (MAH) infected pigs 14 and 24 weeks after the experimental infection. While MAA induced a significant increase of specific antibodies and cell-mediated immunity in infected pigs, MAH-infected pigs had the unvarying level of specific antibodies during the experiment and cell-mediated immunity was detectable only in two pigs at 14 weeks post infection and half of the animals at 24 weeks post infection. Subsequent in vitro macrophage infection with the same mycobacterial strains showed a significantly lower macrophage activation induced by MAH infection in comparison to MAA. Putting data together from both in vivo and in vitro experiments, we can conclude that MAH strains used in the study has low imunogenicity. As suggested in previous two studies, an IFN-γ release assay seems to be a usable tool for discrimination of M. avium infected pigs. This conclusion was confirmed in limited field study where IFN-γ release assay showed higher sensitivity than intradermal test which represents up today the only tool for intravital diagnosis of mycobacteria-infected pigs. In conclusion, the detection of cell-mediated immunity by the IFN-γ release assay seems to be an effective method for the intravital discrimination of M. avium infected pigs. This method showed higher sensitivity in comparison to both detection of specific antibodies and intradermal test. However, IFN-γ release assay fails in the cases when specific adaptive immunity is not induced or induced only weakly.

Keywords

Mycobacterium avium, prase, specifická immunitní odpověď, interferonový test, průtoková cytometrie, pig, specific immunity, IFN-γ release assay, flow cytometry

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 8. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 9. 2010
• Vedoucí: MVDr. Martin Faldyna, Ph.D.
• Oponent: Mjr. RNDr. Zuzana Kročová, Ph.D., Ing. Igor Šplíchal, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Fyziologie živočichů