Lidská N-acetylglukosaminyltransferasa GnT-I a její exprese v odlišných eukaryotických systémech

Bc. Marek Adamus

Diplomová práce

Human N-acetylglucosaminyltransferase GnT-I and its expression in different eukaryotic systems

Anotace:

Posttranslační modifikace proteinů jsou důležitým nástrojem diverzifikace jejich funkce a významně ovlivňují následné biochemické vlastnosti. Jednou z nejvýznamnějších a nejběžnějších modifikací jsou glykosylace, které se významně podílejí na adhezi buněk, či na jejich rozeznávání imunitním systémem. Tato práce se zaměřuje na expresi genu katalytické domény lidské N-acetylglukosaminyltransferasy I (GnT-I) v eukaryotických organismech S. cerevisiae a L. tarentolae umožňujících lidský typ glykosylací. Proběhly kultivace buněk hW303-1A S. cerevisiae ve fermentoru, přičemž byly identifikovány a postupně optimalizovány některé limitující faktory růstu kultury, avšak exprese genu GnT-I nebyla detekována. Následně byl připraven konstrukt pro expresi genu GnT-I v prokaryotickém organismu E. coli, přičemž pro expresi byly vybrány kmeny BL21(DE3), Tuner(DE3) a Rosseta(DE3)pLysSRare, nicméně exprese GnT-I nebyla pozorována. Vzhledem k charakteru eukaryotického proteinu byla provedena izolace inkluzních tělísek a jejich purifikace pomocí afinitní chromatografie, avšak přítomnost GnT-I opět nebyla detekována. Dále proběhla exprese genu GnT-I v buňkách prvoků L. tarentolae. Testována byla 4 média pro zajištění optimálního růstu kultury, přičemž exprese genu GnT-I byla pozorována pomocí fluorescenčního mikroskopu na základě spřažené exprese genu Cherry pro červenou fluorescenci. Přestože u části buněk byla fluorescence detekována, nebyla exprese GnT-I prozatím potvrzena.

Abstract:

Posttranslational modification is crucial for a protein diversification and can gravely influence their biochemical properties. Perhaps the most common as well as the most important one is a glycosylation which takes part in a cell adhesion or in pathogen recognition. This thesis focuses on a gene of a catalytic domain of human N-acetylglucosaminyltransferase I, particularly on its expression in two eukaryotic organisms S. cerevisiae and L. tarentolae engineered for a human-like glycosylations. Yeast cells S. cerevisiae hW303-1A were cultivated repeatedly in a fermentor and while several factors affecting culture growth rate were identified the GnT-I gene expression was not detected. Subsequently a prokaryotic organism E. coli was selected for the expression of our GnT-I gene. Three different strains BL21(DE3), Tuner(DE3) and Rosseta(DE3)pLysSRare were tested for the expression however the GnT-I was not detected. As our gene is of an eukaryotic origin and is mostly produced in an insoluble form an isolation of inclusion bodies was performed. Unfortunately after purification and mass spectrometry analysis the GnT-I was not detected. A protozoan L. tarentolae LEXSY T7-TR was also tested as an expression organism. In order to determine the most suitable conditions for cultivation four different media were tested. The GnT-I expression was checked using a fluorescence microscope due to simultaneous co-expression of Cherry fluorescence gene. Although some cells were clearly producing red fluorescence protein the GnT-I gene expression was not detected.

Klíčová slova

glykosyltransferasy, kvasinky, Saccharomyces cerevisiae, Leishmania tarentolae, N-acetylglukosaminyltransferasa I, GnT-I, glykosyltransferases, yeast, N-acetylglucosaminyltransferase I

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 5. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 5. 6. 2014
• Vedoucí: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Analytická biochemie