Laboratorní diagnostika Helicobacter pylori

Jana OBERMAJEROVÁ

Bachelor's thesis

Laboratory diagnosis of Helicobacter pylori

Abstract:

Helicobacter pylori je gramnegativní zakřivená bakterie, ke svému růstu potřebuje mikroaerofilní prostředí a CO2. Z biochemických vlastností je důležitá produkce ureázy, katalázy, alkalické fosfatázy a fosfolipázy a dalších enzymů. Helicobacter pylori kolonizuje žaludeční sliznici v oblasti antra, při masivní infekci může přecházet i do těla žaludku. Podílí se na rozvoji zánětu žaludeční sliznice a to především sliznice antra, který ve většině případů přechází do chronické fáze. Podílí se na rozvoji peptického vředu duodena a žaludku, je prokázána souvislost s karcinomem a MALT lymfomem žaludku. K diagnostice infekce Helicobacter pylori slouží invazivní a neinvazivní metody. Pro invazivní metody je nutné odebrat bioptický vzorek žaludeční sliznice, který je určený pro histologické nebo mikrobiologické vyšetření. Mezi mikrobiologické metody patří mikroskopické vyšetření, rychlý ureázový test a kultivační vyšetření. Neinvazivní metody (dechový test, průkaz antigenu ve stolici) se zpravidla používají pro ověření eradikační léčby infekce. Tématem práce bylo porovnání jednotlivých mikrobiologických vyšetřovacích metod ? mikroskopie, kultivace a rychlého ureázového testu, které se pro diagnostiku Helicobacter pylori používají na Pracovišti bakteriologie Nemocnice České Budějovice, a.s. Materiálem byly bioptické vzorky žaludeční sliznice zaslané na Pracoviště bakteriologie v roce 2011. Vzorky byly nejčastěji odebírány na Gastroenterologickém oddělení a Dětském oddělení. Každý bioptický vzorek se vždy rozdělil na tři části pro jednotlivé metody. Z části vzorku se zhotovil mikroskopický preparát. K obarvení dle Grama se použil barvicí automat - systém MIRASTAINER?. Při pozorování v optickém mikroskopu (imerzním systémem při zvětšení 1000×) byly v případě pozitivního nálezu patrné štíhlé esovitě zahnuté gramnegativní tyčinky. Další část vzorku se použila pro ureázový test dle Christensena v tekutém médiu. Test se vyhodnotil následující den, pro pozitivitu svědčilo zčervenání média. Zbylá část vzorku se použila pro kultivační vyšetření. Materiál se naočkoval na diagnostickou kultivační půdu HPFA od firmy fa Dulab a souběžně na neselektivní krevní agar (pro vyloučení kontaminující flóry). Kultivace probíhala v mikroaerofilní atmosféře (docílilo se v LAS systému) 5-7 dní při 37 °C. V případě pozitivního kultivačního nálezu (pro H. pylori jsou typické drobnější, našedlé a částečně transparentní kolonie) se testovala citlivost k antibiotikům. Na Pracovišti bakteriologie Nemocnice České Budějovice, a.s. bylo v roce 2011 vyšetřeno 599 bioptických vzorků žaludeční sliznice. Infekce Helicobacter pylori byla prokázána u 161 pacientů. Z výsledků práce vyplývá, že citlivost kultivačního vyšetření je srovnatelná s mikroskopií. Nejnižší citlivost měl ureázový test. Infekce byla diagnostikována nejčastěji ve věkové skupině 40-59 let, z toho bylo 47,5 % mužů a 52,2 % žen. U 137 kmenů Helicobacter pylori byla stanovena citlivost k vybraným antibiotikům. 42 % kmenů bylo rezistentních k metronidazolu a 18 % kmenů k azitromycinu.

Abstract:

Helicobacter pylori is a Gram-negative, microaerophilic bacterium requiring for its growth and development a microaerophilic environment and carbon dioxide. The most important biochemical properties include the production of urease, catalase, alkaline phosphatase, and phospholipase as well as other enzymes. Helicobacter pylori colonises the gastric mucosa in the area of the antrum and may be transferred into the body of the stomach (Corpus gastricum) in the event of massive infection. It contributes to the development of gastric mucosal inflammation, especially the antrum mucosa, which later, in the majority of cases, passes to the chronic stage. It also contributes considerably to the development of both duodenal and gastric peptic ulcers. The connection between carcinoma and gastric MALT lymphoma has been proved. Diagnosis of Helicobacter pylori infection can be made by invasive and non-invasive methods. In order to proceed to the invasive method, a biopsy sample of the gastric mucosa must be taken. This sample is later submitted for histological and microbiological examination. The microbiological methods include microscopic examination, rapid urease test and H. pylori cultivation test. In principal, non-invasive methods (breath test, stool antigen test) are used for the verification of eradical infection treatment. The topic of the thesis dealt with the comparison of individual microbiological examination methods ? microscopy, cultivation and rapid urease test which are used at the Bacteriology Institute of Hospital of České Budějovice, a.s. in order to diagnose Helicobacter pylori. Biopsy samples of the gastric mucosa sent to the Bacteriology Institute in 2011 were used as the main material for the given study. The samples were most frequently taken at the Gastroenterology Department and Children´s Department. Each biopsy sample was divided into three parts for individual methods. A microscopic preparation was elaborated from a part of the sample. The stain device - MIRASTAINER? system was used for the Gram staining. During observations in the optic microscope (immersion lens system with 1000×) fine S-shaped Gram-negative rods were visible in the event of a positive finding. Other parts of the sample were used for the urease hydrolyses test (Christensen´s) in the liquid media. The test was assessed the following day, in the case of a positive finding the media went red. The remaining part of the sample was used for the cultivation examination. The material was inoculated into the HPFA diagnostic cultivation media provided by the Dulab Company and, at the same moment, on non-selective blood agar (in order to exclude contaminating microflora). The cultivation was executed in a microaerophilic atmosphere (obtained in the LAS system) from 5 to 7 days at 37 °C. In the event of a positive cultivation finding (often represented in case of H. pylori by typical, finer, slightly grey and partially transparent colonies) the sensitivity to antibiotics was tested. In 2011, the Bacteriology Department at the Hospital of České Budějovice, a.s. examined 599 biopsy samples of the gastric mucosa. The examination proved the presence of Helicobacter pylori infection in the bodies of 161 patients. The results of the study reveal that the sensitivity of the cultivation examination is comparable to microscopy. The lowest sensitivity was proved in the case of the urease test. The infection was the most commonly diagnosed in the age group between 40 and 59 years (47.5 % of men and 52.2 % of women). The sensitivity to selected antibiotics was determined in the case of 137 phyla. 42 % of phyla were resistant to metronidazole and 18 % of phyla to azithromycin.

Keywords

Helicobacter pylori, mikroaerofilní bakterie, CagA a VacA antigen, žaludeční a duodenální vřed, MALT lymfom, rychlý ureázový test

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 5. 2013

Accessible from:: 3. 5. 2013

Thesis defence

• Supervisor: MUDr. Petra Dovinová

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Technician