Vliv kryoprotektantů při mrazení vodných roztoků na enzymatickou aktivitu

Bc. Jitka Procházková

Master's thesis

The Effects of Cryoprotectants on the Enzymatic Activity upon Freezing of Aqueous Solutions

Abstract:

V této diplomové práci je zkoumán vliv přídavku solí k mrznoucímu pufrovanému roztoku enzymu na enzymatickou aktivitu během procesu mrazení a následném rozmrazení. Pro měření enzymatické aktivity byl jako modelový enzym použit enzym DbjA, který patří do mezi haloalkan dehalogenázy. Roztok enzymu ve fosfátovém pufru byl mrazen při 233 K nebo 77 K. Byl pozorován vliv přítomnosti solí (chloridu amonného a tetramethylamonného) na aktivitu enzymu DbjA po zmrazení a následném rozmrazení. Zachovaná enzymatická aktivita DbjA byla korelována se změnami kyselosti na povrchu ledu způsobenými mrazením. Pro stanovení změn kyselosti byl do vzorků přidán acido-bazický indikátor kresolová červeň a změny protonace indikátoru byly sledovány ve zmrazeném stavu pomocí UV/Vis spektroskopie. Ukázalo se, že vhodná volba přidané soli zabrání změně kyselosti povrhu ledu při mrazení a tak omezí denaturaci přítomného proteinu. Použití přídavku soli k mrazenému či lyofilizovanému roztoku proteinu tak ochrání jeho aktivitu. Tato metoda je navržena jako nová forma kryoprotekce.

Abstract:

In this diploma thesis we investigated the influence of added salt into the buffered enzyme solution on its activity after the freezing and thawing. We utilized the DbjA enzyme, a member of haloalkandehalogenase family, as a model system. The buffered enzyme solution was frozen at 233 K and 77 K. The effect of added salt (ammonium or tetramethylammonium chloride) on recovered activity of the DbjA enzyme after the freeze-thaw cycle was observed. The recovered enzymatic activity was correlated with apparent changes on the ice surface. This was determined by UV/Vis spectroscopy of cresol red, an acid-base indicator, in frozen solutions. We show that addition of proper amount of salt into the buffered enzymatic solution decreases the change in protons concentration on the ice surface and therefore diminishes the enzyme degradation upon the sample freezing. Salt addition to the buffered enzymatic solution therefore protects its activity. This approach is proposed as a new method of cryoprotection.

Keywords

freezing-thawing, freeze-drying, lyophilization, cryoprotectants, denaturation, haloalkane dehalogenase

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 1. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 7. 2. 2013
• Supervisor: doc. Mgr. Dominik Heger, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Chemistry / Organic Chemistry