Kvantifikace proteinů s využitím absorpční spektrofotometrie

Alice ONDOVČÁKOVÁ

Bachelor's thesis

Quantification of proteins using absorption spectrophotometry

Abstract:

Bakalářská práce je zaměřena na stanovení obsahu proteinů z rostlinného materiálu (potažmo z doplňků stravy) za využití metody podle Bradfordové, která je založena na vzniku vazby mezi proteinem a barvivem Coomassie Briliant Blue G250 v kyselém prostředí za vzniku modrého komplexu. Literární přehled uvádí principy, citlivosti, časovou náročnost a vliv interferencí u metod využívajících pro kvantifikaci proteinů absorpční spektrometrii. Druhá polovina teoretické části práce je zaměřena na metodu podle Bradfordové, kde jsou popsány způsoby homogenizace rostlinného materiálu, extrakce proteinů a vlastního stanovení obsahu bílkovin včetně odstranění vlivu interferencí. Praktická část práce je věnována postupu pro stanovení obsahu proteinů v rostlinných vzorcích a ve dvou doplňcích stravy (proteinových nápojích). Odstranění vlivu interferencí bylo provedeno ultrafiltrací pomocí mikrocentrifugačních filtrů. Metodou Bradfordové byly kvantifikovány celkové proteiny u rostlin ječmene setého (Hordeum vulgare L.), pěstovaného za různých podmínek - při různé teplotě (20, 30 a 38 °C) a intenzitě modrého světla (R:G:B 100:100:350, R:G:B 350:100:100), a různé ozářenosti (70 ?mol?m- 2?s-1 a 830 ?mol?m- 2?s-1) v kombinaci bez zalévání a se zaléváním. Vyšší obsah celkových proteinů (vztažených na sušinu) byl zjištěn u rostlin pěstovaných při vyšších teplotách (30 °C, 38 °C) ve srovnání s obsahem u rostlin pěstovaných při 20 °C. Také rostliny pěstovaných při nízké ozářenosti (70 ?mol?m- 2?s-1) měly vyšší obsah proteinů než při ozářenosti vysoké. U proteinových nápojů poskytovala metoda podle Bradfordové vyšší obsah proteinů (oproti údajům výrobce) a to jak v syrovátkovém izolátu, tak i hydrolyzátu.

Abstract:

The Bachelor thesis is focused on determination the protein content of plant material (or dietary supplements) using the Bradford method, which is based on the formation of a bond between the protein and the Coomassie Brilliant Blue G250 dye in an acidic environment, resulting in the formation of a blue complex. The literature review presents the principles, sensitivity, time requirements, and the influence of interferences in methods utilizing absorption spectrophotometry for protein quantification. The rest of the theoretical part of the thesis focuses on the Bradford method, describing the methods of homogenization of plant material, protein extraction, and the estimation of protein content including the removal of interferences. The practical part of the thesis focuses on the procedure for determining the protein content in plant samples and in two dietary supplements (protein drinks). Interference removal was carried out by ultrafiltration using microcentrifuge filters. Total proteins were quantified using the Bradford method in barley (Hordeum vulgare L.) plants grown under various conditions - different temperatures (20, 30, and 38 °C), blue light intensity (R:G:B 100:100:350, R:G:B 350:100:100), and different irradiances (70 ?mol?m- 2?s-1 and 830 ?mol?m- 2?s-1) in combination with watering and without watering. Higher total protein content (per dry matter) was found in plants grown at higher temperatures (30 °C, 38 °C) compared to those grown at 20 °C. Additionally, plants grown under low light intensity (70 ?mol?m- 2?s- 1) exhibited higher protein content than those exposed to high irradiance. For protein drinks, the Bradford method provided higher protein content in the protein drinks (compared to manufacturer´s data), both in whey isolate and in whey hydrolysate.

Keywords

Bradfordova metoda, kvantifikace proteinů, Coomassie Briliant Blue, ječmen

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 1. 5. 2024

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 22. 5. 2024
• Supervisor: Mgr. Irena Kurasová, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Physics / Physics - Biology with Focus on Education