Využití "kroslinkování" k analýze interakcí DNA-protein.

Bc. Lucie PODEŠVOVÁ

Master's thesis

Making use of crosslinking for the analysis of DNA-protein interactions.

Abstract:

Mnoho molekulárně biologických metod by nebylo možné využít pro analýzu DNA proteinových interakcí, kdyby tyto interakce těsně před jejich studiem nebyly nikterak fixovány. Pro fixační účely se používá proces zvaný kroslinkování, který je běžnou součástí téměř všech protokolárních postupů chromatinové imunoprecipitace. Kroslinkování může být uskutečněno několika způsoby. Buď jsou k fixaci DNA proteinových komplexů využita chemická činidla, anebo činidla fyzikální. V této práci byl ke stabilizaci komplexu p53CD-p53CON využíván formaldehyd a glutaraldehyd. Stabilizace komplexu p53CD-p53CON zmíněnými aldehydy měla umožnit zavedení metody footprinting in vitro. Zatímco formaldehyd měl vzhledem k vysokým koncentracím i nesprávně zvolenému pufru značně negativní vliv na stabilitu komplexu p53CD-p53CON, glutaraldehyd vazebné interakce stabilizoval. Stabilizace vazby byla ověřována tepelnou inkubací vzorků při 50 °C. V těchto podmínkách byly u vzorků s využitím glutaraldehydu na agarózovém gelu stále detekovatelné fragmenty odpovídající komplexu p53CD-p53CON, kdežto u formaldehydu tomu tak nebylo. Po čase však bylo zjištěno, že je stabilizační vlastnost glutaraldehydu zapříčiněna jeho schopností kroslinkovat samotné monomery proteinu p53, a vytvářet tak kovalentní vazby v rámci proteinového komplexu. Protein p53 tedy nevytvářel kroslinky na úrovni aminokyselina nukleová báze, ale jeho vyšší stabilita byla zajištěna tímto mechanismem.

Abstract:

Many molecular biological methods can not be used for the analysis of DNA-protein interactions without fixation of such interactions. Crosslinking is the process that enables fixation of DNA-protein interactions which are studied for example by chromatine immunoprecipitation. Crosslinking can be accomplished in several ways. Chemical or physical agents can be used for these purposes. In this work both formaldehyde and glutaraldehyde were used for stabilization of p53CD-p53CON complex. This stabilization should have led to establishment of a method called footprinting in vitro. While formaldehyde had due to the high concentrations and incorrectly chosen buffer negative effect on the stability of the p53CD-p53CON complex, glutaraldehyde stabilized bonding interactions. Stabilization of the binding was verified by heat incubation of the samples at 50° C. In these conditions, in samples where glutaraldehyde was used, fragments corresponding to p53CD-p53CON complex were still detectable on an agarose gel, whereas with formaldehyde were not. It was found after some time, that the stabilizing property of glutaraldehyde was due to its ability of crosslinking p53 monomers themselves and thus create covalent bonds within the protein complex. The p53 protein therefore did not produce crosslinks at the amino acid-nucleic base level, but its higher stability was ensured by this mechanism.

Keywords

Kroslinkování, DPCs, aldehydy, cytostatika, UV záření, těžké kovy, protein p53.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2015

Accessible from:: 27. 4. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 19. 5. 2015
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Pečinka, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Experimental Biology