Cytogenetické vyšetření pacientů s B-chronickou lymfatickou leukémií ve stimulovaných lymfocytech

Bc. Kristina Štěpanovská

Master's thesis

Cytogenetic analysis of patients with B-CLL in stimulated lymphocytes

Abstract:

Specifické chromosomové změny, které jsou pravidelně nacházeny u pacientů s CLL, patří mezi významné prognostické faktory umožňující předvídat průběh nemoci pacienta. Hlavní metodou používanou k detekci těchto chromosomových změn je metoda FISH prováděná na interfázních jádrech lymfocytů. Klasická cytogenetická analýza, která vyžaduje lymfocyty v mitotické fázi cyklu pro sestavení karyotypu lymfocytu, je u pacientů s CLL problematická kvůli nízké proliferační schopnosti maligních lymfocytů in vitro. Tato práce se zaměřuje na ověření vhodnosti interleukinu 2 a oligonukleotidu DSP30 jako stimulantů pro navození dělení maligních B-lymfocytů podle metody publikované Dickerem et al. (2006). Kultivací periferní krve pacientů s těmito stimulanty se podařilo získat metafázní buňky ke stanovení karyotypu lymfocytu u 164 pacientů z celkového souboru 200 pacientů (82,0 %). U 137 z těchto 164 pacientů (83,5 %) byly nalezeny chromosomové změny, přičemž kromě čtyř nejčastěji detekovaných abnormalit u CLL byl objeven také významný počet případů s del(6q) (9,1 % ze 164 pacientů) a s translokacemi (15,2 % ze 164 pacientů). Tyto změny jsou u pacientů s CLL zatím málo prozkoumané, ale je možné, že v budoucnu by mohly sloužit jako další prognostické faktory. Dalším zajímavým zjištěním bylo odhalení komplexních změn karyotypu, které jsou spojeny se špatnou prognózou, u více než čtvrtiny cytogeneticky hodnotitelných pacientů (30,5 % ze 164 pacientů). Vzorky periferní krve byly současně standardně vyšetřovány metodou FISH pro CLL čtyřpanel a získaná data byla následně porovnána s výsledky cytogenetického vyšetření. Toto srovnání odhalilo, že i s použitím stimulantů má cytogenetické vyšetření mnohem nižší úspěšnost v zisku hodnotitelných preparátů (82,0 % vs 99,0 %). Ovšem důležitým faktem je, že pomocí cytogenetického vyšetření byly u 78 pacientů (39,0 % z 200 pacientů) nalezeny další chromosomové změny kromě těch zařazených do čtyřpanelu. Metoda FISH navíc odhalila komplexní změny karyotypu pouze u 2 pacientů. Tyto výsledky naznačují, že metoda FISH neodráží skutečnou variabilitu a složitost chromosomových změn u CLL. Na závěr lze shrnout, že kombinace IL-2 s oligonukleotidem DSP30 přináší technicky nenáročnou možnost, jak navodit dělení maligních lymfocytů pacientů s CLL a zachytit velké množství chromosomových změn, které by pouze metodou FISH nebyly zaznamenány. Zavedení této metody do běžné praxe by nepřineslo žádnou další zátěž pro pacienta, protože ke stimulaci se využívá periferní krev stejně jako v případě metody FISH. Používání metody v rutinním vyšetřování pacientů společně s metodou FISH by jednoznačně přispělo ke zvýšení záchytu chromosomových změn a lepšímu porozumění jejich charakteru, což by v budoucnu mohlo pomoci získat více informací o prognóze pacienta a zlepšit kvalitu péče o něj.

Abstract:

Specific chromosomal abnormalities regularly detected in patients with CLL are important prognostic factors which enable to predict patient's clinical course. Main role in detection of these abnormalities plays FISH analysis applied to interphase cells. Chromosome banding analysis that reguires cells in mitotic cell cycle phase have been scarce due to low proliferative activity of malignant B-cells in vitro. The objective of this thesis was to evaluate a method suggested by Dicker et al. (2006). The method relies on application of interleukin 2 and oligonucleotide DSP30 as malignant B-cell mitogens. Patients' peripheral blood samples were cultivated with these stimulants and metaphases for chromosomal banding analysis were successfully generated in 164 of 200 cases (82.0 %). Chromosomal abnormalities were detected in 137 of these 164 cases (83.5 %) and it is interesting to note that except four most common abnormalities in CLL, a significant number of patients have del(6q) (9.1 % of 164 patients) or translocations (15.2 % of 164 patients). Little is known about these aberrations and their impact on prognosis but it is possible that in future they could serve as additional prognostic factors. It is also remarkable that more that one quarter of evaluated patients (30.5 % 164 patients) have complex aberrant karyotype which is connected with inferior prognosis. Peripheral blood samples were analysed by FISH method for CLL panel in parallel to chromosomal banding analysis. Data obtained from both methods were compared and this comparison revealed that chromosomal banding analysis enabled to evaluate much lower number of samples than FISH method even when IL-2 and oligonucleotide DSP30 were used (82.0 % vs 99.0 %). But more importantly, chromosomal banding detected abnormalities in addition to those covered by CLL panel in 78 cases (39.0 % of 200 patients). Moreover, FISH method detected complex aberrant karyotype only in two patients. These results suggest that FISH analysis doesn't reflect the heterogeneity and complexity of chromosomal abnormalities in CLL. In conclusion, results indicate that use of interleukin 2 in combination with oligonucleotide DSP30 is an easy option how to induce proliferation of malignant B-cells in patients with CLL. This method allows to detect a substantial number of chromosomal aberrations in addition to those detected by FISH method. Since FISH method is usually performed on peripheral blood samples, application of chromosomal banding analysis using peripheral blood stimulated with IL 2 and DSP30 to routine diagnostics wouldn't be another stress for patients. Using chromosomal banding analysis in paralell to FISH method in routine diagnostics definitely would improve detection of chromosomal abnormalities and would be helpful for better understanding of the abnormality pattern. In future it might help to get more information about CLL patients' prognosis and help in taking care of them.

Keywords

CLL, chromosomové změny, stimulace periferní krve, cytogenetické vyšetření, chromosomal abnormalities, IL-2, DSP30, cytogenetic analysis

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 7. 6. 2011
• Supervisor: RNDr. Alexandra Oltová

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular Biology and Genetics