Sekvenční variabilita klastrových genů u kmenů Claviceps purpurea produkující ergoidní alkaloidy

Josef Vrabka

Bachelor's thesis

Sequence polymorphism of cluster genes encoding for ergoid alcaloid metabolism pathway in different strains of Claviceps purpurea

Abstract:

Claviceps purpurea je parazitická houba z oddělení Ascomycetes využívaná ve farmakologickém průmyslu díky její schopnosti produkovat námelové alkaloidy. Námelové alkaloidy slouží jako výchozí surovina pro výrobu léků na léčbu migrény, bolestí hlavy, Parkinsonovy nemoci a Alzheimerovy choroby. Enzymy biosyntetické dráhy jsou kódovány geny nacházejícími se v klastru. Gen dmaW kóduje enzym prvního kroku biosyntézy, spojení isoprenylové skupiny s tryptofanem. Gen easC je předpokládaný regulační gen celého klastru. Metodou PCR s užitím proof-reading Phusion polymerasy byly z genomové DNA WT C. purpurea získány amplikony genů dmaW a easC, které byly ligovány do pDrive plasmidu a klonovány do TOP10 E. coli elektroporací. Metodou a- komplementace byly vybrány kolonie pozitivních bakterií. Plasmidy s inzertem byly zpětně izolovány a zaslány na sekvenaci. Sekvence genu dmaW se u jednotlivých klonů lišily a byly rozřazeny do 4 podobných skupin. Tento výsledek nasvědčuje, že gen dmaW se ve WT C. purpurea vyskytuje ve více kopiích. Sekvence genu easC se nevyznačovaly variabilitou v nukleotidovém složení. Nulová variabilita v genu easC potvrzuje hypotézu jeho možné funkce jako regulačního genu celého klastru

Abstract:

Claviceps purpurea is a parasitic fungus of the division Ascomycetes used in pharmacological industry due to its ability to produce ergot alkaloids. Ergot alkaloids are used as basic drug-stock for production of medicaments to treat migraine, headaches, Parkinson's disease and Alzheimer's disease. Biosynthetic pathway enzymes are encoded by genes located within a cluster. Gene dmaW encodes an enzyme in the first step of biosynthesis, the isoprenylation of tryptophan. Gene easC is supposed to control the expression of entire gene cluster. By PCR using proof-reading Phusion polymerase, gene amplicons of dmaW and easC were obtained from genomic DNA of wild-type C. purpurea strain, which were ligated into pDrive plasmid and cloned into TOP10 E. coli using electroporation. Colonies of positive bacteria were chosen using a-complementation method. Plasmids with inserts were isolated and sequenced. Sequences of dmaW varied in individual clones and were divided into 4 groups based on homology. This result suggests that the gene dmaW in wild-type C. purpurea strain occurs in multiple copies. Sequences of easC did not show any variability in nucleotide composition. Zero variability in the gene easC confirms its putative function as the regulatory gene of the cluster

Keywords

Claviceps purpurea, genový klastr, námelové alkaloidy, variabilita

Keywords

Claviceps purpurea, gene cluster, ergot alkaloids, variabilita

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 5. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 4. 6. 2010
• Supervisor: Petr Galuszka
• Reader: Dana Šafářová

Univerzita Palackého

Přírodovědecká fakulta

Bachelor programme / field:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie