Degradace beta-mikroseminoproteinu (MSP) na povrchu kančích spermií během in vitro kapacitace

Bc. Veronika Martínková

Diplomová práce

Degradation of beta-microseminoprotein (MSP) on the boar sperm surface during in vitro capacitation

Anotace:

Pokud má být spermie schopna oplození vajíčka, musí projít zásadním procesem – kapacitací. Během ní dochází ke změnám cytoplazmatické membrány spermie, zvyšuje se tyrosinová fosforylace v proteinech, stoupá pH a dochází k nárůstu motility spermie.Cílem této práce bylo detekovat a lokalizovat beta-mikroseminoprotein (β-MSP) v kančích spermiích a zjistit, zda se jeho zastoupení mění během kapacitace spermií v médiu s inhibitory ubiqutin-proteazomového systému a zda je tudíž tento systém zapojen do jeho degradace během kapacitace.Při experimentech bylo použito pět různých typů vzorků kančích spermií. Prvním typem byly spermie ejakulované, druhým spermie kapacitované in vitro v nemodifikovaném médiu, třetím spermie kapacitované s inhibitorem proteazomu (MG-132), čtvrtým spermie kapacitované s inhibitorem ubiqutin aktivujícího enzymu (PYR-41) a pátým spermie kapacitované s rozpouštědlem použitým pro inhibitory – DMSO. Vzorky byly zpracovány metodou nepřímé imunofluorescence a imunodetekce.Výsledky experimentu ukazují výskyt β-MSP v akrozomální oblasti hlavičky spermie a spojovacím a hlavním oddílu bičíku. Tento vzor lokalizace byl zaznamenán ve všech vzorcích spermií, ovšem u spermií podrobených kapacitaci byla intenzita značení nižší a lokalizace v akrozomu byla omezena na jeho apikální část. Pouze u spermíí kapacitovaných s inhibitorem proteasomu MG-132 byla zaznamenána vyšší intenzita fluorescence než u kapacitovaných spermií v nemodifikovaném médiu. Imunodetekce ukázala významně nižší množství proteinu ve vzorcích spermií kapacitovaných (v modifikovaném i nemodifikovaném médiu) než ve spermiích ejakulovaných. Naproti tomu ve vzorku spermií kapacitovaných s inhibitorem MG-132 bylo množství proteinu signifikantně vyšší než v extraktu spermií kapacitovaných v médiu bez inhibitoru.Naše výsledky naznačují možné zapojení ubiqutin-proteazomového systému do degradace β-MSP během kapacitace kančích spermií.

Abstract:

In order fertilize an oocyte, sperm must undergo fundamental process – capacitation. During this process changes in cytoplasma membrane of the sperm occur, the protein tyrosin phosphorylation intensity increses, the pH rises and the sperm motility increases.The aim of this work was to detect and lokalize beta-microseminoprotein (β-MSP) in boar spermatozoa and determine its concentration during the sperm capacitation in medium containig inhibitors of ubiquitin-proteasome system, and whether this system is invoved in its degradation during capacitation.Five different samples of boar sperm were used in the experiments. The first type was ejaculated spermatozoa, the second was in vitro capacitated spermatozoa in unmodified medium, the third was capacitated sperm in medium containing proteasomal inhibitor (MG-132), the fourth was capacitated sperm in medium containing inhibitor of ubiquitin activating enzyme (PYR-41) and the fifth was capacitated sperm in medium containing solvent used for inhibitors – DMSO. Samples were processed by indirect immunofluorescent method and immunodetection.The experimental results show the presence of β-MSP in acrosomal part of the sperm head and the connecting and principal piece of tail. This localization pattern was found in all sperm samples, but in capacitated spermatozoa the intensity of the labeling was lower, and the acrosome localization was limited to its apical part. Only the spermatozoa capacitated with the proteasomal inhibitor MG-132 showed a higher fluorescence intensity than the capacitated spermatozoa in the unmodified medium. Immunodetection showed a significantly lower amount of protein in capacitated sperm samples (both in modified and unmodified media) than in ejaculated spermatozoa. In contrast, in the sperm sample capacitated with MG-132 inhibitor, the amount of protein was significantly higher than in extract from spermatozoa capacitated in inhibitor-free medium.Our results suggest possible involvement of the ubiqutin-proteasome system in the β-MSP degradation during sperm boar capacitation

Klíčová slova

kapacitace, proteazom, imunodetekce, spermie

Keywords

spermatozoa, capacitation, proteasome, immunodetection

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie