Sledování markerů kapacitačního procesu u kančích spermií

Renáta Fajtová

Diplomová práce

Monitoring markers of capacitation process in boar sperms

Anotace:

Ejakulované spermie, které opustí samčí reprodukční soustavu, nejsou schopné navázat se na zonu pellucidu a prodělat akrozomální reakci a oplodnit oocyt. Tuto schopnost získávají během kapacitačního procesu, při kterém dochází k modifikaci spermie, jak na úrovni hlavičky, tak bičíku. Spermie se v samičí reprodukční soustavě vážou na epiteliální buňky vejcovodu a vytvoří oviduktální rezervoár spermií. Po odštěpení některých dekapacitačních faktorů z povrchu spermie dochází k přerušení vazby mezi spermiemi a epitelem vejcovodu, což vede k uvolnění spermií, které začnou kapacitovat. Odštěpení cholesterolu zapříčiní zvýšení permeability a fluidity plazmatické membrány a možnost přísunu iontů do buňky. Pro vstup vápenatých iontů (Ca2+) do intracelulárního prostoru je nutný eflux zinečnatých iontů (Zn2+), neboť Zn2+ blokují kanál HVCN1, který reguluje intracelulární pH, a tím ovlivňuje iontový kanál specifický pro spermie CatSper, kterým vstupují Ca2+ do buňky. Přísun iontů způsobí spuštění kaskády reakcí, které vedou k tyrozinové fosforylaci (PTyr), hyperaktivaci pohybu a kapacitaci spermie. Kapacitaci lze indukovat i v in vitro podmínkách za využití kapacitačních médií. Cílem této diplomové práce bylo popsat změny ve spermiích během in vitro kapacitace se zaměřením na vhodné detekční markery kapacitačního procesu. Základem hypotézy byl předpoklad, že při detekci PTyr nepřímou imunofluorescencí budou při využití čtyř druhů fixace detekovány různé fluorescenční vzory, a že ne všechny zvolené fixace budou spolehlivě odlišovat kapacitované spermie od nekapacitovaných. Naše výsledky ukázaly, že prostřednictvím protilátky proti akrozinu ACR.2 lze spolehlivě rozlišit in vitro maturační stádia kančích spermií. Jelikož je kapacitace nezbytným krokem k podstoupení akrozomální reakce, použitím PNA lektinu jsme detekovali 71% zastoupení akrozomálně zreagovaných spermií a z toho jsme vyvodili, že tyto spermie musely prodělat kapacitaci. Detekce a hodnocení PTyr byla provedena nepřímou imunofluorescencí s využitím čtyř druhů fixačních činidel. Při použití fixace 70% acetonem a 2% formaldehydem ve vodě s 2% BSA v suspenzi lze spolehlivě odlišit ejakulované a kapacitované spermie, neboť dochází ke změně fluorescenčního vzoru. Prokázán byl i vliv fixace na fluorescenční vzor. Při detekci změny v PTyr nebyl metodou Western blot prokázán statisticky významný rozdíl. Použitím Cholesterol Quantitation Kit MAK043 a kolorimetrie jsme vyhodnocovali eflux cholesterolu. Dále jsme pomocí fluorescenční sondy FZ3 a přímé fluorescence sledovali eflux Zn2+. Eflux cholesterolu ani Zn2+ se nám prokázat nepodařilo, jelikož je nezbytné metody ještě optimalizovat. Z našich výsledků vyplývá, že během kapacitace dochází ke změnám, které lze detekovat pomocí markerů s odlišnou spolehlivostí.

Abstract:

Ejaculated sperm that leave the male reproductive system are unable to attach to the zona pellucida and undergo an acrosomal reaction to fertilize the oocyte. They acquire this ability during the capacitation process, during which the sperm is modified both at the level of the head and the flagellum. In the female reproductive system, sperm bind to the epithelial cells of the fallopian tube to form the oviductal reservoir of sperm. Upon cleavage of certain decapacitating factors from the surface of the sperm, the bond between the sperm and the epithelium of the fallopian tube is broken, resulting in the release of sperm that begin to capacitate. Cholesterol cleavage causes an increase in the permeability and fluidity of the plasma membrane and the possibility of ion influx into the cell. Efflux of zinc ions (Zn2+) is required for calcium ions (Ca2+) to enter the intracellular space, as Zn2+ block the HVCN1 channel that regulates intracellular pH, thereby affecting the sperm-specific ion channel CatSper through which Ca2+ enters the cell. The influx of ions triggers a cascade of reactions that leads to tyrosine phosphorylation (PTyr), hyperactivating sperm movement and capacitation. Capacitation can also be induced under in vitro conditions using capacitation media. The aim of this thesis was to describe the changes in sperm during in vitro capacitation with a focus on suitable detection markers of the capacitation process. The base of the hypothesis was that different fluorescence patterns would be detected using four types of fixation when detecting PTyr by indirect immunofluorescence, and that not all fixations chosen would reliably distinguish capacitated sperm from non-capacitated sperm. Our results showed that in vitro matriculation stages of boar sperm can be reliably distinguished using the anti-acrosin antibody ACR.2. Capacitation is a necessary step to undergo an acrosomal reaction, using the PNA lectin we detected 71% representation of acrosome-reacted sperm and inferred that these sperm must have undergone capacitation. Detection and evaluation of PTyr was performed by indirect immunofluorescence using four types of fixatives. Using fixation with 70% acetone and 2% formaldehyde in water with 2% BSA in suspension, ejaculated and capacitated spermatozoa could be reliably distinguished because of the change in fluorescence pattern. The effect of fixation on the fluorescence pattern has also been proven. The change in PTyr was detected by Western blotting and no statistically significant difference was found. Cholesterol efflux was evaluated using the Cholesterol Quantitation Kit MAK043 and colorimetry. Furthermore, we monitored Zn2+ efflux using the FZ3 fluorescent probe and direct fluorescence. We were unable to detect cholesterol or Zn2+ efflux, as the methods still need to be optimized. Our results show that changes that occured during the capacitation, can be detected by markers with different reliability.

Klíčová slova

marker, metody detekce, fixace, spermie, kapacitace, akrozin, fosforylace proteinů

Keywords

marker, detection methods, fixation, sperm, capacitation, acrosin, protein phosphorylation

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 28. 4. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 21. 5. 2024
• Vedoucí: MVDr. Romana Krejčířová, Ph.D.
• Oponent: Jana Jankovičová, externi

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / specializace:
Biotechnologie / Reprodukční biotechnologie