Vliv cyklosporinu A na aktivaci prasečího oocytu

Daniela Tupá

Master's thesis

The effect of cyclosporine A on porcine oocyte activation

Abstract:

Aktivace oocytů je složitý děj, který zahrnuje prolomení druhého meiotického bloku, kortikální reakci, dokončení druhého meiotického dělení a vydělení druhého pólového tělíska. Aktivace je regulována celou řadou faktorů, z nichž mnohé nejsou dosud objasněny. Mezi nejdůležitější faktory ovlivňující aktivaci oocytu je vzestup hladiny intracelulárního vápníku a následné oscilace. Oscilace vápníkových iontů v oocytu jsou vyvolány penetrující spermií, která vnáší do oocytu pro spermii specifický faktor fosfolipázu C izoformu zeta (PLCzeta). PLC zeta hydrolyzuje fosfatidylinositol 4,5-bisfosfát (PIP2), následkem toho vzniká inositoltrifosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG), IP3 mobilizuje intracelulární Ca2+. Ten následně aktivuje kalmodulin dependentní kinázu II (CaMKII). Mezi proteiny závislé na hladině vápníku a kalmodulinu patří i serin/treonin protein fosfatáza 2B neboli kalcineurin. Ten se skládá z katalytické podjednotky A a z regulační podjednotky B. Role kalcineurinu při aktivaci oocytu byla prokázána u bezobratlých a nižších obratlovců. U savců byla jeho přítomnost zaznamenána v rostoucích a zrajících oocytech prasete. Lze předpokládat, že je kalcineurin zapojen i v regulaci procesů spojených s aktivací oocytu prasete. Cílem práce bylo zjistit, zda se kalcineurin podílí na aktivaci prasečích oocytů. Hypotéza byla ověřována pomocí inhibice kalcineurinu cyklosporinem A během aktivace oocytu prasete. Nejprve však byla ověřena přítomnost obou podjednotek kalcineurinu pomocí nepřímé imunofluorescence v oocytech ve stádiu MII a v partenogeneticky aktivovaných oocytech. Podjednotky kalcineurinu A i B byly lokalizovány zejména v korové oblasti zralých i aktivovaných oocytů. Ve druhém experimentu byly zralé oocyty ošetřeny cyklosporinem A a následně partenogeneticky aktivovány kalcium ionoforem A 23187. U této skupiny oocytů bylo zaznamenáno signifikantní snížení aktivace na 23,5 %, na rozdíl od kontrolní skupiny oocytů ošetřených pouze kalcium ionoforem s mírou aktivace přesahující 80 %. Na základě výsledků se lze domnívat, že je protein kalcineurin zapojen do procesu aktivace savčího oocytu.

Abstract:

Activation of oocytes is complex process which includes the exit from the second meiotic arrest, the cortical reaction, the second meiotic division completion and the second polar body extrusion. The activation is regulated by a number of factors and many of them have not been elucidated yet. One of the most important factors affecting the activation of oocyte is the rise of Ca2+. In oocyte, Ca2+ oscillations is triggered by a sperm-specific factor phospholipase C, PLC zeta. Phospholipase C hydrolyzes phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) and this leads to formation of IP3 and diacylglycerol (DAG). IP3 mobilizes intracellular calcium. Ca2+ then activate calcium/calmodulin dependent protein kinase II (CaMKII). One of the proteins dependent on the level of calcium and calmodulin is Ser/Thr protein phosphatase 2B, so-called calcineurin. This consists of the catalytic subunit A and the regulatory subunit B. The role of calcineurin in oocyte activation has been shown in invertebrates and lower vertebrates. In mammals its presence has been reported in growing and maturing pig oocytes. Can be assumed that calcineurin is involved in regulation of processes associated with activation of porcine oocytes too. The aim of this master's work was to investigate whether calcineurin participates in porcine oocyte activation. The hypothesis was tested using calcineurin inhibition with cyclosporin A during the oocyte activation. First, however, was verified the presence of both calcineurin subunits using indirect immunofluorescence in MII oocytes and parthenogenetically activated oocytes. The calcineurin subunits A and B were localized especially within the cortex in matured and activated oocytes. In the second experiment, matured oocytes were treated with cyclosporin A and then parthenogenetically activated with calcium ionophore A 23187. In this group of oocytes was observed a significant decrease of activation to 23,5 %, in contrast to the control group treated only with calcium ionophore with activation rate over 80 %. Based on these results it can be assumed that the protein calcineurin is involved in the activation process of mammalian oocyte.

Keywords

aktivace, kalcineurin, cyklosporin, prase, oocyt

Keywords

oocyte, activation, calcineurin, cyclosporine, porcine

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 4. 2015

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Lenka Tůmová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction