Molekulární determinace pohlaví u vybraných ptačích druhů

Marcela Kvapilová

Master's thesis

Molecular determination of sex in selected avian species

Abstract:

Determinace pohlaví u ptáků podle vnějších charakteristik je často velmi obtížná, zejména u monomorfních druhů a mláďat, proto se pro jejich určení pohlaví využívají molekulární metody. V současné době je nejpoužívanější metodou technika polymerázové řetězové reakce (PCR), která pomocí specifických primerů amplifikuje CHD gen. Tento gen se vyskytuje u samic, které jsou heterogametní (ZW), na chromozómech W (CHDW) a Z (CHDZ). Zatímco u samců, kteří jsou homogametní (ZZ), se CHD gen nalézá pouze na chromozómu Z (CHDZ). Po elektroforetické separaci PCR produktů jsou na gelu charakteristické dva fragmenty pro samice, kdežto pro samce jeden fragment. V této diplomové práci byly testovány čtyři páry primerů (P2/P8, 2550/2718, 2987/3112 a 3007/3112) pro amplifikaci CHD genů u 40 druhů ptáků z 24 čeledí. Produkty PCR reakce byly separovány na 3% agarózovém gelu. Pro potvrzení získaných výsledků byla provedena kapilární elektroforéza na automatickém DNA analyzátoru pro separaci produktů získaných PCR reakcí s fluorescenčně značenými primery P2/P8-6FAM. Tyto primery byly vybrány z důvodu své téměř univerzálnosti pro determinaci pohlaví u ptáků. Celkový počet testovaných jedinců byl 313. U tří jedinců se pohlaví determinovat nepodařilo. Pro molekulární determinaci pohlaví byli k dispozici pouze samci u šesti druhů ptáků z celkových 40 druhů. Nebylo tedy možné určit, které primery jsou u těchto druhů vhodné pro determinaci pohlaví. Ze získaných výsledků vyplývá, že nejvhodnějšími primery pro molekulární determinaci pohlaví u ptáků jsou primery 2550/2718, které při elektroforetické separaci PCR produktů na 3% agarózovém gelu umožnily určit pohlaví u 34 druhů. Stejně tak úspěšné byly i primery P2/P8-6FAM, ale z důvodu malého velikostního rozdílu mezi amplikony musela být použita pro separaci amplikonů získaných pomocí těchto primerů kapilární elektroforéza na automatickém DNA analyzátoru. Produkty PCR reakce s primery P2/P8, které byly elektroforeticky separovány na 3% agarózovém gelu, umožnily determinovat pohlaví pouze u 10 druhů. Pomocí primerů 3007/3112 bylo pohlaví determinováno u 11 druhů a primery 2987/3112 umožnily určit pohlaví u 23 druhů ptáků

Abstract:

Avian sex determination by external characteristic is very difficult, especially in monomorphic species and nestlings. For this reason molecular methods for avian sex determination are being applied. The polymerase chain reaction (PCR) is the most used method nowadays. PCR with specific primers provides amplification of a CHD gene. The CHD gene occurs in heterogametic female (ZW) on the chromosomes Z (CHDZ) and W (CHDW). While in males, which are homogametic (ZZ), the CHD gene is only on the Z chromosome (CHDZ). After electrophoresis separation two bands on the gel are typical for female and one band is typical for male. In this study 4 pair primers for CHD gene amplification (P2/P8, 2550/2718, 2987/3112 and 3007/3112) were tested in 40 species from 24 families. PCR products were separated on a 3% agarose gel. To confirm obtained results a capillar electrophoresis on the automatic DNA analyzator was used. PCR products obtained by PCR amplification with fluorescently labeled primers P2/P8-6FAM were separated by capillar electrophoresis. These primers were chosen because of their nearly universality for avian sex determination. We tested 313 individuals in total. The sex determination failed in 3 individuals. There were only males in 6 species from 40 for analysis, so it was difficult to tell which primers could be suitable to determinate the sex in these species. Obtained results suggest that the optimal primers for avian molecular sexing are 2550/2718, which determinated the sex in 34 species by using a 3% agarose gel for electrophoresis separation. In the same way the primers P2/P8-6FAM were also successful. A capillar electrophoresis on the automatic DNA analyzator due to a very small size differences between P2/P8-6FAM amplicons had to be applied. Primers P2/P8, whose amplicons were separated on 3% agarose gel, determinated sex in 10 species only. By using primers 3007/3112 was determinated sex in 11 species and by using primers 2987/3112 was determinated sex in 23 species

Keywords

CHD gen, determinace pohlaví u ptáků, PCR, primery P2/P8, 2550/2718, 2987/3112, 3007/3112, kapilární elektroforéza

Keywords

CHD gene, avian sex determination, PCR, primers P2/P8, 2550/2718, 2987/3112, 3007/3112, capillar electrophoresis

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 9. 6. 2009
• Supervisor: Lenka Kučerová
• Reader: Petr Nádvorník

Univerzita Palackého

Přírodovědecká fakulta

Master programme / field:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie