Aktivita SCF komplexu v průběhu preimplantačního vývoje skotu.

Veronika Kinterová

Master's thesis

Activity of SCF complex during preimplantation development of cattle.

Abstract:

Časný embryonální vývoj je závislý na několika kritických událostech, mezi které patří i aktivace embryonálního genomu (EGA), kdy začíná syntéza embryonálních transkriptů. Maternální mRNA jsou z embrya odstraněny, ale degradace maternálních proteinů zůstává prozatím neobjasněna. Velké množství proteinů je odstraňováno pomocí ubikvitin -- proteazomového systému, a proto je pravděpodobné, že i maternální proteiny podléhají této degradaci. Proteiny určené k odstranění musejí být označeny ubikvitinem procesem zvaným ubikvitinylace. Toho se účastní tři enzymové systémy a to: E1 (ubikvitin-aktivující), E2 (ubikvitin-konjugující) a E3 (ubikvitin-ligázy) enzymy. Předpokládáme, že alespoň část maternálních proteinů je degradovaná za účasti SCF komplexu, který patří mezi zástupce E3 enzymů. Proto bylo účelem této diplomové práce sledovat aktivitu SCF komplexu v průběhu preimplantačního vývoje. Cílem bylo potvrdit hypotézu, že jeho aktivita se po EGA zvyšuje a ve stádiu blastocysty narůstá v oblasti trofoektodermu. Pro tento pokus byla vybrána bovinní embrya, u kterých byla provedena imunofluorescenční metoda a metoda In situ proximity ligation assay (PLA). Výsledky imunofluorescenční metody cílené na dílčí proteiny SCF komplexu (Cul1, Skp1 a Rbx1) dokazují, že všechny tyto proteiny jsou přítomny během celého preimplantačního vývoje. Dále byla provedena metoda PLA, která zprostředkovává interakci mezi dvěma proteiny a navíc i detekuje lokalizaci této interakce. V našem případě jsme pozorovali vazbu mezi Cul1 a Skp1, jejichž interakce je stěžejní pro aktivaci SCF komplexu. Ta prokázala přítomnost aktivního SCF komplexu u všech vývojových stádií embrya. U výsledných snímků byla měřena hodnota fluorescenčního signálu a výsledky byly podrobeny statistické analýze. Ta prokázala statisticky významné rozdíly mezi oocyty v MII fázi a 2 - 4buněčnými embryi. Mezi ostatními stádii se signifikantní rozdíl neprokázal, tudíž nelze potvrdit vzrůstající aktivitu po EGA. Ve stádiu blastocysty se projevila nerovnoměrná lokalizace Cul1 a Skp1 a následně i aktivita SCF komplexu, která byla ve vnitřní buněčné mase (ICM) znatelně nižší než v trofoektodermu (TE). To potvrzuje druhou část naší hypotézy, která říká, že aktivita SCF komplexu narůstá ve stádiu blastocysty v oblasti trofoektodermu.

Abstract:

Early embryonic development is dependent on several critical events including embryonic genome activation (EGA). It is the event when synthesis of the embryonic transcripts starts. Maternal mRNA is removed from embryos, but degradation of maternal proteins remains unclear up to now. A large amount of proteins is removed by the ubiquitin -- proteasome system, and therefore the maternal proteins are assumed to be degraded the same way. Proteins destined for degradation are tagged by ubiquitin in process called ubiquitination. This is attended by three enzymatic systems, namely: E1 (ubiquitin-activating enzyme), E2 (ubiquitin conjugating enzyme) and E3(ubiquitin ligase). We presumed that at least some of the maternal proteins are degraded by the participation of the SCF complex, which is one of the E3 enzymes. Therefore, the purpose of this thesis was to observe the activity of this SCF complex during preimplantation development. The aim of this thesis was to confirm the hypothesis that activity of the SCF complex increases after EGA and grows in trophoectoderm (TE) at the blastocyst stage. Our model organism were bovine embryos and the main methods we used were an immunofluorescence and In situ proximity ligation assay (PLA). Results of immunofluorescence, which targeted proteins of SCF complex (Cul1, Skp1 and Rbx1), demonstrate that these proteins were present throughout whole preimplantation development. PLA method enables the detection of interaction between the two proteins and moreover the detection of its localization. We observed the interaction between Cul1 and Skp1, whose binding is crucial for the activation of SCF complex. The results showed the presence of active SCF complex at all stages of embryonic development. The value of fluorescence signal was measured and subjected to statistical analysis. The results showed statistically significant differences between the MII stage oocytes and 2 -- 4c stage embryos. There were not any significant differences between the other stages and the growing activity after EGA cannot be confirmed. At the blastocyst stage there were showed irregular localizations of Cul1 and Skp1 and subsequently the activity of the SCF complex, which was in the inner cell mass (ICM) significantly lower than in TE. This confirmed the second part of our hypothesis, which says that the activity of SCF complex is increasing in TE in the blastocyst stage.

Keywords

preimplantační vývoj, Cullin1, Skp1, bovinní embryo, SCF komplex

Keywords

SCF complex, preimplantation development, Cullin 1, Skp1, bovine embryo

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 4. 2015

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Mgr. Markéta Sedmíková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction