Exprese vybraných cytokinů a signálních molekul u plicních onemocnění se zánětlivou složkou

Bc. Denisa PAULŮ

Master's thesis

Expression profiling of cytokines and signalling molecules in inflammatory diseases

Abstract:

Sarkoidóza patří mezi multisystémové zánětlivé onemocnění s neznámou příčinou. Toto onemocnění je typické Th1 imunitní odpovědí, přičemž důležitou roli v její patogenezi hrají imu-nitní buňky a cytokiny. Nedávné studie prokázaly také roli Th17 buněk v patogenezi sarkoidózy. Dosud je však velmi málo známo o molekulách účastnících se Th17 imunitní odpovědi u sarkoi-dózy a jejích klinických fenotypů. V první části diplomové práce byla proto zkoumána mRNA relativní exprese interleukinu (IL)-23 a jeho receptoru IL-23R v buňkách získaných bronchoal-veolární laváží. Tyto molekuly by měly hrát důležitou roli ve směřování T-lymfocytů do fenotypu Th17 buněk a v jejich udržování a proliferaci. Soubor tvořilo sedmdesát čtyři pacientů s plicní sarkoidózou a sedmnáct kontrolních jedinců bez známek zánětu. Byla použita metoda kvantita-tivní reverzní transkripce-polymerázové řetězové reakce. Relativní exprese mRNA příslušných molekul byla hodnocena metodou druhé derivace s využitím PSBM2 jako referenčního genu a cDNA přepsané z lidské univerzální referenční RNA jako kalibrátoru. Naše studie prokázala zvýšenou mRNA expresi genu pro IL-23 (p=0,002) i jeho receptoru IL-23R (p$<$0,0001) u pacientů se sarkoidózou oproti kontrolním jedincům. Při srovnání pacientů dle klinického vývoje one-mocnění po dvou letech jsme pozorovali zvýšenou mRNA expresi IL-23R u pacientů s progresí onemocnění oproti pacientům s regresí (p=0,02). V druhé části diplomové práce byla studována možná souvislost mezi zvýšenou expresí IL-23R u pacientů s progresí a dvěma funkčními jednonukleotidovými polymorfismy v tomto genu. Genotypizace polymorfismů zkoumaného genu IL-23R byla provedena pomocí technologie MassArray a DNA byla získána z krve sto osmnácti pacientů, u kterých byl znám vývoj onemocnění po dvou letech. Alelické i genotypové frekvence běžné i vzácné alely se nelišily mezi skupinami pacientů, u kterých došlo k remisi a progresi onemocnění. V této práci jsme potvrdili zvýšenou expresi dvou klíčových molekul Th17 imunitní dráhy: IL-23 a IL-23R u plicní sarkoidózy. Exprese IL-23R byla zvýšena u progredující formy onemocnění, neprokázali jsme však vliv studovaných funkčních polymorfismů na zvýšení mRNA exprese. Studium Th17 buněk a molekul asociovaných s Th17 imunitní odpovědí u sarkoidózy bude jistě předmětem dalšího výzkumu.

Abstract:

Sarcoidosis belongs among multisystemic inflammatory disease of unknown cause. This disease is typical for Th1 immune response. Important role in this phenotype play immune cells and cytokines. Recent studies have revealed the role of Th17 cells in sarcoidosis pathogenesis but there is limited information about molecules participating in Th17 immune response of sarcoidosis and its clinical phenotypes. In the first part of master thesis the relative expression of mRNA of interleukine IL-23 and its receptor IL-23R in cells obtained from bronchoalveolar lavage was studied. These molecules are suggested to play an important role in the development of T-lymphocytes into Th17 cell phenotypes, their maintenance and proliferation. The data were collected from 74 patients with lung sarcoidosis and 17 control subjects without inflammation. Quantitative reverse transcription ? polymerase chain reaction was performed. The relative mRNA expression of studied molecules was quantified by second derivate method using PSMB2 as a reference gene and cDNA transcripted from human universal reference RNA as a calibrator. Our study revealed higher mRNA expression for IL-23 gene (p=0.002) and its receptor IL-23R (p$<$0.0001) in sarcoidosis patients when compared to control subjects. We observed higher IL-23R mRNA expression in patients after 2-year sarcoidosis with progression in comparison with regression (p=0.002). The possible correlation between higher IL-23R expression in patients with progression and two functional single-nucleotide polymorphisms in this gene was studied in the second part of master thesis. Genotypization of IL-23R polymorphism was performed by MassArray technology. DNA was obtained from peripheral blood of 118 patients with 2-year sarcoidosis. The distribution of allele and genotype frequencies did not differ between our remitting and progressing patients. In conclusion we confirmed higher expression of two key molecules of Th17 immune pathway: IL-23 and IL-23R in lung sarcoidosis. The expression of IL-23R was higher in the progression form of disease, but we did not prove the influence of studied functional polymorphism on stimulation of the mRNA expression. The study of Th17 cells and molecules associated with Th17 immune responses in sarcoidosis will be the case of future studies.

Keywords

Sarkoidóza, interleukin 23, receptor pro interleukin 23, kvantita-tivní RT-PCR, genotypizace.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 4. 2012

Accessible from:: 23. 4. 2012

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Eva Kriegová, Dr.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry